10 低氧、力竭运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡及bcl-2、bax表达的影响

杨海平（广东省肇庆学院体育学系）

细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，是目前世界范围内生物学和医学领域研究的热点。细胞凋亡是多细胞生物生命活动中不可缺少的组成内容，是一个正常的生理过程，是动物、人借以存活的需要，因而贯穿于生物全部生命活动中。细胞增殖和细胞死亡的平衡维持对多细胞有机体的发育与生命的维持至关重要。一旦调控细胞凋亡的信号途径遭遇破坏，无论这种损伤来自于细胞外的触发剂、获得性原因、遗传性突变或是病毒所致，都可引起一系列人类疾病包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病、多种神经退化性疾病等。凋亡细胞在形态上和生物化学方面均有别于坏死细胞。细胞凋亡代表一种清除损伤、感染或不需要细胞的机制，它具有特殊形态改变，是一种不引起周围组织的炎性反应的单个细胞的死亡。凋亡出现时伴有细胞核、胞浆致密、细胞器互相靠近；染色质浓缩，沿着核膜排列，形成不同形状和大小的块状，然后染色质逐步分裂为碎片；与此同时细胞器也发生浓缩失去水分，而后细胞膜下陷，包裹核碎片和细胞器，形成凋亡小体。而细胞坏死表现为胞体、细胞器肿胀，细胞膜破裂，形成小泡；染色质聚集成块，不均一，染色质DNA被随机降解，有严重的炎症反应。机体通过凋亡将携带不可修复DNA损伤的细胞处死，从而避免DNA损伤遗传给后代细胞。这对维持机体的正常运转和防止肿瘤的产生具有十分重要的意义。

目前，国内外研究人员对多种组织细胞的凋亡现象进行了全面研究，取得一定进展，但对运动刺激引起细胞凋亡现象的研究还比较滞后，特别是对骨骼肌细胞凋亡的研究更是少见，经联机检索美国国家图书馆，得知关于运动训练和骨骼肌细胞凋亡的研究论文仅有二十几篇。尽管目前细胞凋亡仍是医学、生物学研究的热点，但在运动人体科学中尚未引起足够的重视，国内这方面的研究更是寥若星辰。近几年医学、运动人体科学界对肌肉细胞的凋亡也进行了研究，已探明肌肉在一定条件下可发生细胞凋亡，其凋亡的形态学、生物化学特点与一般的凋亡细胞特点一致，与坏死细胞的形态学、生物化学特点大相径庭。相对而言，骨骼肌细胞因运动训练而诱发细胞凋亡的研究尚属起步探索阶段，因此，细胞凋亡在运动性肌肉损伤与修复机制中占何地位，起何作用；就目前国内外关注的低氧刺激而言，细胞凋亡又占何地位、起何作用，这些急需更多的实验研究来探索、阐明。对骨骼肌细胞凋亡进行细胞、基因水平的研究，将会使运动人体科学的研究向更深的领域发展，将使人们从一个全新的角度去认识运动对骨骼肌的影响，有利于探索运动对骨骼肌的影响机制，为运动训练、运动康复、运动治疗、基因治疗提供一定的理论依据。

高原训练作为提高运动能力的一种训练方法，已有半个世纪的历史。从一些已经取得良好效果的事例分析，体育界认为高原训练是一种有效的训练方法。HiLo训练法是高住低练（Living high and training low）的简称，是在传统的高原训练基础上发展起来的一种有效的提高运动耐力的科学方法。这种训练方法是美国学者莱文（Levine）首先提出的，它能克服传统高原训练的不足之处，有逐渐取代传统高原训练的趋势。目前，有关高原训练对骨骼肌影响的研究主要包括以下几个方面：骨骼肌的毛细血管变化、骨骼肌酶、骨骼肌的肌红蛋白浓度、肌肉缓冲能力、肌肉中的蛋白氧化、骨骼肌α-肌动蛋白基因表达的影响。而外来的损伤，如果程度轻微，例如不太剧烈的温度改变，轻度的放射，抗癌药，甚至低氧，也可引起凋亡；近来的证据指出缺氧通过凋亡的方式诱导细胞死亡，而非坏死，缺氧期间的凋亡信号是通过细胞色素C（Cytc）释放和细胞凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）介导的caspase-9激活而引起的；Catherine等的研究证明bax（bcl-associated x protein，bcl-2相关x蛋白：与bcl-2促细胞存活的作用相反，bax促细胞凋亡）及bcl-2（bcl-2及其家族是调节细胞凋亡的主要基因，目前已经发现15 个成员，按功能可分为抗凋亡，如bcl-2、bcl-XL 等，和促凋亡，如bax、bad、bid等两大家族，其编码的蛋白质作用于线粒体，双向调节细胞凋亡）蛋白常氧下在骨骼肌中存在基本的表达，在缺氧条件下，肌肉适应需要bcl-2过度表达，以避免由于线粒体机能障碍而导致的细胞死亡；凋亡前体及抗凋亡蛋白的蛋白印记分析表明运动后即刻bcl-2相对bax水平下降，而运动后96小时比值出现倒转，从本质上而言，这促进了运动后即刻细胞的死亡，而4天后将有助于细胞存活。单独低氧或疲劳刺激可以增加活性氧的形成。但是，疲劳刺激与低氧的结合可引起更复杂的环境变化，将产生更多的有害自由基，钙离子释放受到抑制。大量的数据提示发生在肌肉收缩后的初期损伤，起因是机械性损伤，随后触发级联式反应，导致特征性的力量产生下降、延迟性肌肉酸痛及细胞溶质蛋白的释放。许多潜在的途径将影响继发的过程，包括自由基活性增强、肌肉钙离子内环境稳定性失调及局部肌肉缺血，但是所涉及的确切机制还不清楚。如此看来，有关低氧训练对骨骼肌细胞凋亡的影响就值得研究，低氧运动是否可引起更加严重的细胞凋亡，以及细胞凋亡与基因表达的时相是何关系，都不十分清楚，因此，无论从填补国内外空白的角度，还是为高原训练的运动实践服务，进行此项研究，无疑都有着重要的理论意义和实践意义。

另外，有关骨骼肌损伤的机制，学者们从多方面、多角度进行了阐述，并提出许多有关肌肉损伤机制的假说，但目前肌肉损伤的确切机制尚不十分清楚，对于运动性骨骼肌结构、机能变化机制的解释并不令人十分满意。目前，国内外有关骨骼肌损伤与细胞凋亡这方面的实验研究极其少见，但这为探索肌肉损伤机制提供了新的研究思路。本研究拟从细胞凋亡的角度入手，对骨骼肌细胞凋亡与骨骼肌损伤的发生有何内在关系进行初步研究。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物分组及取材

1.1.1 力竭实验

7周龄雌性SD大鼠128只，体重220±25克，动物分批购入，分笼饲养。适应两天，每天一次5～10分钟跑台运动，以便熟悉跑台，速度为5～10米/分，坡度为0度。两天后随机分成常氧和低氧两大组，常氧组设安静对照组（exhausting control，EC）和一次性力竭（normal oxygen exhausting group，OE）运动后即刻、1、2、4和7天组（分别表示为OE0、OE1、OE2、OE4和OE7）。低氧组动物在低氧舱适应3天后再进行分组，分为低氧安静对照（hypoxic control，HC）即刻、1、2、4和7天组（分别表示为HC0、HC1、HC2、HC4和HC7）和低氧力竭运动（hypoxic exhausting group，He）后即刻、1、2、4和7天组（分别表示为He0、He1、He2、He4和He7），动物分组共计16组，每组8只大鼠。常氧组动物饲养环境温度为22±3℃，自然光照。低氧组动物放置在氧分压为12.7%的低氧舱中（相当于海拔4000米高度）。低氧和常氧运动组大鼠一次性力竭运动均在常氧环境下进行。力竭模式采用跑台运动，动物在跑台上进行下坡跑，跑台的坡度是-16 °，速度16 m/min，运动至力竭。运动中采用声、光刺激或毛刷机械刺激鼠尾部，或中间适当休息2～4分钟，在整个运动过程中无电刺激。当动物出现卧位跑，反应迟钝，“逃避反应”极差，短时间休息后（低于10分钟）仍无法持续运动，则视为力竭。

力竭实验组所有动物均自由饮食，动物及饲料由河北医科大学实验动物中心提供。全部动物训练在河北体育科学研究所动物室进行，时间为2003年4月16～5月20日。

1.1.2 动物取材

各组动物均于安静状态下，先用2%的戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血处死。取右侧比目鱼肌置于4%中性多聚甲醛固定液中固定，以备组织切片的制备，每组取6只大鼠做石蜡包埋。

1.2 实验仪器及试剂

1.2.1 主要实验仪器

低氧舱系统设备：HYPOXIC TRAINING SYSTEMS（HTS），美国Hypoxico公司制造；RT-1904 C半自动生化分析仪：中国深圳雷杜（Rayto Electronics）公司制造；显微镜：德国产LEICA DMRXA显微镜；图像分析仪：德国产LEICA Q550 CW图像分析系统；组织病理切片机：SHANDON，英国制造；低温高速离心机：Anke GL-20 G-H，上海安亭科学仪器厂制造。

1.2.2 主要实验试剂

SSR DNA Marker II：由北京鼎国生物技术有限公司提供，编号SD011；原位TUNEL检测试剂盒：由北京华美生物工程公司提供；bax试剂盒，编号sc-526及bcl-2试剂盒，编号sc-492均由北京中山生物技术有限公司提供Santa Cruz Biotechnology公司生产的产品。

1.3 实验指标与方法

1.3.1 HE染色

将4%中性多聚甲醛固定液中固定的肌组织块入梯度酒精脱水（75%→85%→95%→100%→100%），二甲苯透明，石蜡包埋，切片，切片厚度5 μm。再进行二甲苯脱蜡，梯度酒精入水（100%→95%→85%→75%），蒸馏水2分钟，苏木精染色，自来水冲洗，1%盐酸酒精分色，自来水冲洗， 1%伊红染色，自来水冲洗，蒸馏水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在10 × 10倍光学显微镜下观察标本，确定观察位置，然后在40 × 10 倍下观察肌纤维、肌节、肌外膜、染色质等结构。

1.3.2 bcl-2及bax免疫组化染色

bcl-2和bax蛋白免疫组织化学检测试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。石蜡切片常规脱蜡至水，由专业人员严格按照试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。bcl-2及bax免疫反应产物的标记强度用平均光密度值（A）表示，每组从6张切片中随机选3张切片，在40×10倍放大倍数下随机选择3个视野进行图像分析（用LEICA Q550CW图像分析系统），测定bcl-2和bax的A值。调节系统去除本底后测量特异染色的平均光密度值。用bcl-2和bax蛋白的A值减背景A值得到校正A值（CA值），即bcl-2和bax免疫反应的实际A值，用CA值进行分析，以避免染色过程中非特异性染色造成的误差。

1.3.3 细胞凋亡检测

原位TUNEL细胞凋亡检测试剂盒由北京华美生物工程公司提供。标本切片常规脱蜡至水，由专业人员严格按照试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木素轻度复染，蒸馏水洗、脱水、透明、封片。细胞核中有棕色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。每组从6张切片中随机选3张切片，在40×10倍放大倍数下随机选择5个视野进行图像分析（使用LEICA Q550CW图像分析系统），计数凋亡核和正常细胞核数目，按如下公式计算凋亡核占总细胞核数的比例。凋亡核比例=凋亡细胞核/（凋亡核+正常细胞核）×100%。

1.3.4 细胞凋亡DNA断裂的电泳分析

取骨骼肌100毫克→PBS漂洗2次，去除血液→剪碎组织，加入400 μl裂解缓冲液，匀浆（不需特别剧烈）→8000 rpm，离心5 min→上清液加10% SDS至1%（40 μl），颠倒混匀，同时加蛋白酶K至50 μg/ml（5 μl），颠倒混匀→37℃水浴保温1 h，可适当延长→颠倒混匀后，加入1/10体积3 M乙酸钠（PH：5.2），2倍体积冰乙醇（无水乙醇）→-20℃放置1 h以上，充分沉淀DNA→12000 rpm， 4℃，20 min，取沉淀晾干→将沉淀溶于20 μl的TE中（PH：8.0）→取10 μl进行1%琼脂糖凝胶电泳2～3 h，电压50 v，加一滴EB→电泳结束后，紫外灯下观察实验结果并照相（方法由河北医科大学免疫组化教研室提供，同时参考文献2）。凋亡细胞随着核酸内切酶的活化，DNA降解成寡聚核小体，这些降解片段均是为180～200 pb的倍数，通过电泳可形成典型的“梯状带”。

1.3.5 数据处理

数据均使用SPSS11.5统计软件进行处理，测试结果以“平均数±标准差”表示，采用单因素方差分析进行各组间及组内的差异显著性检验。显著性检验水平为P＜0.05。

2 实验结果

2.1 力竭组低氧及跑台训练后大鼠骨骼肌HE染色的观察结果

EC、HC0、HC1、HC2、HC4、OE4、OE7、He4各组（图1），表现为正常的组织学结构，肌纤维排列紧密、规则，肌膜完整且清晰，肌横纹规则整齐。而OE0、OE1、OE2、He0、He1、He2各组（图2），大部分部位肌膜模糊，肌细胞显微结构已发生明显改变，可见肌节紊乱，同时出现细胞核染色质浓缩、靠近核膜、核膜增后现象。大部分线粒体肿胀，水性变及空泡化，内膜、嵴破坏溶解改变。HC7及He7组肌细胞纤维结构未发生明显改变，稍有肌节紊乱，小部分肌细胞出现凋亡特征。

2.2 力竭组低氧及跑台训练后大鼠骨骼肌细胞凋亡TUNEL检测结果

由表1可知，组间比较的结果为运动后即刻组OE0、He0的骨骼肌细胞凋亡测值明显高于EC组，且有非常显著性差异，同时此2组亦明显高于HC0组，也有非常显著性差异；运动后1天组与即刻组的比较结果一致；运动后2天组亦与即刻、1天组类似；运动后4天组间比较无显著性差异；7天组比较结果为HC7、He7测值高于EC组，且有显著性差异，同时HC7 高于OE7，HC7 高于He7 组测值，均有显著性差异。

注：1）为OE0与EC比较，P＜0.001；2）为He0与EC比较，P＜0.01；3）为OE0与HC0比较，P＜0.001；4）为He0与HC0比较，P＜0.001；5）为OE1与EC比较，P＜0.01；6）为He1与EC比较，P＜0.001；7）为OE1与HC1比较，P＜0.01；8）为He1与HC1 比较，P＜0.001；9）为OE2 与EC比较，P＜0.001；10）为He2 与EC比较，P＜0.01；11）为OE2与HC2比较，P＜0.001；12）为 He2 与 HC2 比较，P＜0.01；13）为 HC7 与 EC 比较，P＜0.05；14）为He7与EC比较，P＜0.05；15）为OE7与HC7比较，P＜0.05；16）为He7与OE7比较，P＜0.05。

注：1）为HC7与EC比较，P＜0.01；2）为HC7与HC0比较，P＜0.05；3）为HC7与HC1比较，P＜0.001；4）为HC7与HC2比较，P＜0.01；5）为HC7与HC4比较，P＜0.05；6）为OE0与EC比较，P＜0.001；7）为OE1与EC比较，P＜0.01；8）为OE2与EC比较，P＜0.001；9）为OE4与OE0比较，P＜0.001；10）为OE7与OE0比较，P＜0.001；11）为OE2与OE1比较，P＜0.05；12）为OE4 与OE1 比较，P＜0.01；13）为OE7 与OE1 比较，P＜0.01；14）为OE2与OE4比较，P＜0.001；15）为OE7与OE2比较，P＜0.001；16）为He0与EC比较，P＜0.001；17）为He1与EC比较，P＜0.001；18）为He2与EC比较，P＜0.001；19）为He4与He0比较，P＜0.01；20）为He7与He0比较，P＜0.01；21）为He4与He1比较，P＜0.01；22）为He7与He1比较，P＜0.01；23）为He2与He4比较，P＜0.001；24）为He7与He2比较，P＜0.01；25）为OE1与OEO比较，P＜0.05；26）为He7与EC比较，＜0.05。

由表2可知，组内比较的结果为低氧对照组 HC7 的骨骼肌细胞凋亡测值明显高于 EC、HC1、HC2组，且有非常显著性差异，同时高于HC0、HC4组，且有显著性差异，由此可以看出HC7组细胞凋亡数目最多，其他组相互比较无显著性差异；常氧运动组的比较结果为OE0、OE1、OE2组均高于EC组，有非常显著性差异，同时OE2高于OE1、OE4、OE7组，且有显著性差异，可以得知常氧运动组运动后即刻、1天及2天时凋亡增加，但最高时相出现在运动后即刻与第2天；低氧运动组的比较结果为He0、He1及He2组明显高于EC组，且有非常显著性差异，同时He0、He1及He2亦明显高于He4及He7组，且有非常显著性差异，由此可以看出低氧运动后即刻、1 天及2 天时凋亡增加，至第4天已经基本恢复至正常值，而He7高于EC且有显著性差异，说明第7天时骨骼肌细胞凋亡出现反复，又有凋亡出现。

2.3 力竭组低氧及跑台训练后大鼠骨骼肌bcl-2免疫组化检测结果（表3）

注：1）为OE0与HC0比较，P＜0.05；2）为OE1与EC比较，P＜0.001；3）为He1与EC比较，P＜0.01；4）为OE1与HC1比较，P＜0.05；5）为HC2与EC比较，P＜0.01；6）为OE2 与EC比较，P＜0.05；7）为He2 与EC比较，P＜0.01；8）为HC7与EC比较，P＜0.01；9）为He7与HC7比较，P＜0.05。

组间比较的结果为运动后即刻组OE0的骨骼肌细胞bcl-2蛋白表达明显低于HC0组，且有显著性差异；1天组间比较结果为OE1、He1组明显低于EC组测值，且有非常显著性差异，同时OE1低于HC1，且有显著性差异；2 天组比较结果为HC2、He2 明显低于EC，且有非常显著性差异，OE2亦低于EC，但仅有显著性差异；4天组间比较无显著性差异；7天组间的比较结果为HC7低于EC，且有非常显著性差异，同时HC7低于He7，存在显著性差异。

组内比较的结果为低氧对照组运动后即刻组HC0 的骨骼肌细胞bcl-2 蛋白表达明显高于HC2、HC7组，且有非常显著性差异，HC2低于EC，有显著性差异，HC4高于HC2、HC7，且有非常显著性差异；常氧运动组运动后OE0、OE1低于EC，且有非常显著性差异，OE2低于EC，且有显著性差异，而OE0、OE1低于OE4，且有非常显著性差异，OE1低于OE7，且有显著性差异，总体时相变化趋势为OE4、OE7表达水平较高；低氧运动组运动后He1、He2明显低于EC，且有非常显著性差异，而He4明显高于He0、He1、He2，且有非常显著性差异，He7 高于He1、He2，且有非常显著性差异，从低氧运动后的时相来看，He4、He7表达水平较高，并且与EC比较无显著性差异。

2.4 力竭组低氧及跑台训练后大鼠骨骼肌bax免疫组化检测结果（表4）

组间比较的结果为运动后即刻组He0的骨骼肌细胞bax蛋白表达高于EC、HC0组，且有显著性差异；1天组间比较结果为He1明显高于EC、HC1，且有非常显著性差异；2天组间比较结果为OE2明显高于EC，且有非常显著性差异，同时He2亦高于EC，且有显著性差异；4天及7天组间相互比较无显著性差异。

注：1）为He0与EC比较，P＜0.05；2）为He0与HC0比较，P＜0.05；3）为He1与EC比较，P＜0.01；4）为He1与HC1比较，P＜0.01；5）为OE2与EC比较，P＜0.01；6）为He2与EC比较，P＜0.05。

组内比较的结果为低氧对照组随着时间的变化骨骼肌细胞bax蛋白表达有升高的趋势，但各时刻之间相互比较无显著性差异；常氧运动组各时相比较的结果为OE2蛋白表达高于EC组，且有显著性差异，其他各时相比较无显著性差异，总体变化趋势表现为OE2表达最强；低氧运动后各时相比较的结果为He0高于EC，且有显著性差异，He1亦高于EC，但有非常显著性差异，总体变化趋势为低氧运动后即刻、第1天表达逐步升高，然后下降恢复至安静水平。

2.5 力竭组低氧及跑台训练后大鼠骨骼肌bcl-2/bax免疫组化检测结果（表5）

注：1）为He0与EC比较，P＜0.05；2）为He0与HC0比较，P＜0.05；3）为OE1与EC比较，P＜0.01；4）为He1与EC比较，P＜0.001；5）为He1与HC1比较，P＜0.01；6）为HC2与EC比较，P＜0.01；7）为OE2与EC比较，P＜0.05；8）为He2与EC比较，P＜0.001；9）为HC7与EC比较，P＜0.05。

组间比较的结果为运动后即刻组骨骼肌细胞bcl-2/bax蛋白表达比值组间比较的结果为He0低于EC组，且有显著性差异，同时He0低于HC0，且有非常显著性差异；1天组间比较结果为OE1、He1明显低于EC，且有非常显著性差异，同时He1低于HC1，且有非常显著性差异；2天组间比较结果为HC2、He2明显低于EC，且有非常显著性差异，OE2亦低于EC，且有显著性差异；4天组间相互比较无显著性差异；7天组间比较结果为HC7低于EC，且有显著性差异。

组内比较的结果为低氧对照组HC2的骨骼肌细胞bcl-2/bax表达比值明显低于EC、HC0组，且有显著性差异，HC0组比值高于HC7 组，且有显著性差异；常氧运动组运动后各时相比较结果为OE1、OE2低于EC组比值，且有显著性差异，同时OE4高于OE1、OE2 组比值，且有显著性差异，总体变化趋势为运动后即刻、1天、2天逐步下降，随后开始升高，至4天、7天时恢复至安静水平；低氧运动组运动后各时相的比较结果为He0、He1、He2各时相比值明显低于EC组比值，且有非常显著性差异，至四天时He4 明显高于He0、He1、He2，且有非常显著性差异，同时He7 高于He1、He2的比值，且有显著性差异，总体变化趋势类似与常氧运动组，但程度强于常氧运动组。

2.6 力竭组低氧及跑台训练后大鼠骨骼肌DNA断裂的电泳分析结果

由图3可见，OE0、OE1及OE2组DNA电泳后成为特异性的“梯形带”模式，而OE4及OE7组DNA电泳后呈正常模式。低氧力竭组与常氧力竭组相似，但He7呈现凋亡特征。

低氧对照组HC7出现“梯形带”模式，而其他各组电泳后呈正常模式。

3分析与讨论

以上研究结果显示，急性力竭实验组中低氧对照组bax、bcl-2、bcl-2/bax的表达及TUNEL法测试细胞凋亡的结果表明随着低氧暴露时间的延长，至第7天时bax表达与安静对照组无统计学差异， bcl-2表达低于安静对照组（P＜0.01），bcl-2/bax比值下降，TUNEL检测凋亡明显（P＜0.05），证明低氧暴露7天能够引起骨骼肌细胞凋亡明显增加。

对急性力竭组中常氧、低氧运动组不同时相的观察，发现常氧运动后即刻、1 天及2 天TUNEL法检测骨骼肌凋亡较之安静对照组明显增加，最高时相出现在运动后即刻及2天，且有统计学意义；同时bcl-2在运动后即刻、1天及2天时表达下降，而bax在2天时表达增加；bcl-2/bax比值运动后1、2天下降，运动后4、7天比值发生总体转变：bcl-2 相对于bax表达过度，这导致肌纤维存活。另外，力竭低氧运动组的结果揭示，运动后TUNEL法检测凋亡与常氧诱导相似；同时bcl-2在运动后1天及2天时表达下降，而bax在运动后即刻、1天时表达增加，早于常氧运动组；bcl-2/bax比值运动后即刻、1天、2天下降，总体变化趋势类似于常氧运动组，本质上，运动后即刻、1 天及2 天比值下降促进了运动后细胞的死亡，而4、7天后比值相对上升将有助于细胞存活。以上揭示凋亡变化的各项指标相互印证，运动后大鼠骨骼肌bcl-2水平下降，这种抗凋亡线粒体蛋白的下降可以部分地解释急性运动后凋亡发生率的增加；同时bax在bcl-2表达下降时增加或相对增加，以及bcl-2/bax比值的倒转又部分地肯定了力竭运动后即刻、1天、2天诱导了骨骼肌细胞凋亡。Carraro等对正常鼠运动后凋亡的时相进行了研究，使用电镜证实正常鼠的肌核在一昼夜鼠轮跑后出现特殊的凋亡特征，并且在运动后6及72小时出现增加。肌核DNA碎片和超微结构改变于一昼夜本能的鼠轮运动后即刻和6h被观察到，并且在其后的4 天已经减少，这些与本文的研究结果非常一致。这提示低氧、常氧急性力竭运动后骨骼肌细胞凋亡的速度起初很快，当肌肉经过充分的休息后凋亡开始下降，最后恢复正常。HE染色及DNA电泳分析的结果也对上述实验结果给予了较好的证明。

本实验对低氧、力竭运动后正常大鼠的凋亡时相变化进行了研究，选择的模型足以诱导肌纤维产生损伤，凋亡测试时间间隔的选择也符合肌纤维细胞损伤的开始、高峰和延迟性肌肉酸痛的时相。在骨骼肌损伤最为严重的时相，本实验观察到亦是细胞凋亡严重的时刻，同时自由基活跃、线粒体钙超载、bcl/bax比值下降，自由基生成过多可直接攻击生物膜，生物膜功能的破坏不仅可造成细胞跨膜能量、物质代谢障碍，还可造成线粒体、内质网等细胞器功能障碍，致使ATP生成减少；而Ca2+的摄入导致肌质网钙离子储存能力的饱和，Ca2+继续摄入将引起胞浆游离钙增加，进一步导致线粒体Ca2+超载，而线粒体Ca2+超载已证实会导致结构损伤及能量衰竭，随之而来的ATP短缺将干涉Ca2+-ATPase介导的Ca2+在肌质网的再次积聚，导致进一步的胞浆游离钙浓度增加。普遍认同凋亡是一种主动的、需要能量的过程。Richer等提出细胞ATP水平是细胞死亡、凋亡或坏死的决定因素。这种假设得到间接证据的支持，与大多数可得到的数据是一致的，它是老化的结果，符合直接的实验测试结果。持相同观点的作者认为只要保持一定的ATP水平细胞就能维持生存，当ATP低于此水平时，可为随之发生的凋亡提供足够的ATP，以确保能量需要式的凋亡过程，如大分子酶的蛋白水解、浓缩及出疱形成，只有当细胞内ATP严重下降时，将控制细胞死亡停止，坏死发生。细胞ATP水平下降是细胞死亡的特征，Smets等证明细胞的bcl-2基因表达和能量状况高度相关，并且这两个参数对糖皮质激素诱导的凋亡的敏感性相反。本实验发现低氧、力竭运动后骨骼肌细胞凋亡数目明显增加，此结果使运动后骨骼肌损伤的机制清楚地显示出来。因此，从本研究结果可以推测细胞凋亡可能也是造成低氧、力竭运动后骨骼肌损伤机制之一。低氧暴露7天及低氧、常氧运动期间激活了骨骼肌细胞的自杀程序，可能是由于低氧及运动期间钙离子内环境紊乱和/或活性氧生成增加而造成的，这是一种上调促凋亡基因及下调抗凋亡基因的机制，因而肌细胞通过激活DNA碎片和蛋白酶系统的过程来发起凋亡的过程。

低氧、力竭运动后各时相骨骼肌细胞凋亡的结果表明，TUNEL法检测细胞凋亡及免疫组化法检测bax、bcl-2结果基本一致，两种方式运动后即刻、1、2、4天并未出现统计学差异，低氧、常氧力竭运动后变化趋势基本一致，表明低氧、常氧力竭运动后大鼠骨骼肌细胞凋亡进程相似，说明常氧运动后低氧恢复没有降低或加深骨骼肌细胞凋亡，但常氧、低氧运动后7天TUNEL法检测He7组凋亡高于EC组，而OE7却与EC无显著性差异，说明运动对骨骼肌凋亡的影响在第7天基本消除，而低氧对骨骼肌凋亡的影响作用开始显现。袁建琴的研究证实，低氧、力竭运动后低氧和常氧状态下大鼠骨骼肌损伤进程相似，低氧不能明显加速或加深损伤。本研究与此非常一致，使我们有理由相信力竭运动后低氧和运动的双重作用并非简单的叠加，这涉及到低氧运动引起骨骼肌变化的内在机制，而在这方面未知的东西还很多，有待学者们进一步深入研究。

4 主要结论

4.1 急性力竭实验组中低氧对照组bax、bcl-2、bcl-2/bax的表达及TUNEL法测试细胞凋亡的结果揭示低氧暴露7天能够引起骨骼肌细胞凋亡明显增加。

4.2 对急性力竭组中常氧、低氧运动组不同时相的观察，发现运动后即刻、1天及2天骨骼肌凋亡较之安静对照组明显增加，最高时相出现在运动后2天，且有统计学意义。

4.3 急性低氧、力竭运动后激活了大鼠骨骼肌细胞的自杀程序，可能是由于运动后钙离子内环境紊乱，或活性氧生成增加而造成的。

4.4 从本研究可以推测细胞凋亡可能是造成低氧、力竭运动后骨骼肌损伤机制之一；低氧、常氧力竭运动后大鼠骨骼肌细胞凋亡进程相似，说明常氧运动后低氧恢复没有降低或加深骨骼肌细胞凋亡。

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