11 人参茎叶皂甙对过度训练大鼠血淋巴细胞DNA损伤的影响

李素萍（韩山师范学院体育系） 常 波（沈阳体育学院运动生理生化教研室）

1 前言

淋巴细胞是机体细胞免疫功能的承担者，是机体免疫反应的重要调节细胞，其功能活性的变化直接关系到机体细胞免疫功能的强弱。目前多数研究集中在运动对淋巴细胞数目、亚群、细胞增殖方面，国内尚未见到运动对淋巴细胞DNA影响的相关报道。过度训练可导致免疫抑制，这种抑制是否与淋巴细胞DNA损伤有关？研究过度训练与淋巴细胞DNA的关系对于深刻认识过度训练导致免疫抑制的机理，以及采用合理的手段防治过度训练都有重要意义。本文通过慢性动物实验，探讨过度训练对血液淋巴细胞DNA损伤及其引起免疫抑制的机理，以及人参茎叶皂甙对这种损伤是否具有保护作用，为人参茎叶皂甙延缓或消除运动性疲劳的研究提供实验依据。

2 实验材料与方法

2.1 实验对象

实验用雄性Wistar大鼠45只，体重200克左右，由沈阳市双义实验动物研究所提供，常规分笼饲养。环境温度为23±3℃，每天定时通风，自由饮水，饲料由沈阳医学院实验动物中心提供。每日记录饮食量、体重、清洗饮水器，隔日清洗、消毒笼具，更换垫料，每周室内消毒2次。

2.2 药物

人参茎叶皂甙，由沈阳药科大学神经药理教研室提供，给药前按20.83 mg/kg体重用蒸馏水配成所需溶液。大鼠灌胃量为1 ml/100 g，安静对照组和运动对照组按1 ml/100 g体重用蒸馏水灌胃。

2.3 实验设计

Wistar大鼠随机分为3组，正常对照组（NC组）12只、运动对照组（EC组）17 只、运动+人参组（EP组）16只。大鼠在玻璃池中进行游泳训练，玻璃池规格：100 × 60 × 70 ㎝，水温34±2℃，每天光照12小时，水深50cm，每只大鼠游泳面积＞300cm2。游泳方案参照朱全建立的模型，并作改进，训练情况如下：

2.4 实验方法

最后一次训练结束，随机剔除多余大鼠，24小时后，采用眼眶取血方法，把血样置于无抗凝剂的离心管中，于4℃静置使其充分凝固，以3500转/分钟的转速离心15分钟，取上清液待用。

采用单细胞凝胶电泳法（SCGE）、硫代巴比妥酸法（TBA）、黄嘌呤氧化酶法（XO）和二硫代二硝基苯甲酸法（DTNB）分别测定血液淋巴细胞的DNA损伤、血清丙二醛（MDA）的含量、血清超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。

2.5 统计学处理

所有数据用SPSS10.0数据软件包进行处理，均采用平均数±标准差（±SD）表示，组间采用单因素方差分析（ANOVA）判断总体显著性差异，显著性水平定在P＜0.05和P＜0.01。

3 结果

3.1 6周递增负荷过度训练后各组大鼠血清MDA含量、SOD和GSH-Px活性的变化（table 1）

3.1.1 与NC组相比，EC组大鼠血清MDA含量显著增加（P＜0.01）；血清SOD和GSH-Px活性显著下降（P＜0.01）。

3.1.2 与EC组相比，EP组大鼠血清MDA含量显著下降（P＜0.01）；血清SOD和GSH-Px活性显著增高（P＜0.01）。

Table 1 Changes of MDA、SOD、GSH-Px in serum of rats in different groups（±SD）（n=8）

Note：compared with NC group：△△ P＜0.01 compared with EC group：** P＜0.01

3.2 6周递增负荷过度训练后各组大鼠血液淋巴细胞DNA损伤的情况（table 2，graph1-3）

本试验采用单细胞凝胶电泳法检测单个血液淋巴细胞的DNA损伤，通过尾长、尾矩、椭圆矩等指标来反映DNA的损伤情况。

尾长（Tail length），即沿电泳方向“彗星”尾部最远端与头部中心间的距离，是损伤DNA碎片的迁移长度，在低损伤剂量范围内与损伤剂量成线性关系。当损伤因素作用剂量大到一定程度时， DNA损伤程度明显增加而尾长基本不变。

尾矩（Tail moment）是指尾部DNA占总DNA的百分比与头、尾部中心间距的乘积。

椭圆矩（Olive moment）是以“彗星”头部中心点为零点，沿电泳方向将“彗星”按一定的间隔分成若干个区域（80个即可），分别测定每个区域荧光强度（Di，代表该区域DNA量）、该区域中心距零点的距离（Xi）、“彗星”总荧光强度（Dt，代表总DNA量），则椭圆矩定义为∑（Di × Xi）/Dt。由于定义尾矩时，将“彗星”尾部当作一个整体考虑，将头尾部中心间距当作损伤DNA的平均迁移距离。但事实上尾部DNA的分布并不均匀，所以椭圆矩与作用剂量间的相关性比尾矩更密切。

3.2.1 与NC组相比，EC组大鼠血液淋巴细胞Tail length、Tail moment和Olive moment显著增加（P＜0.01）。

3.2.2 与EC组相比，EP组大鼠血液淋巴细胞 Tail length、Tail moment和Olive moment显著降低（P＜0.01）。

Table 2 Changes of the DNA damage in rat lymphocyte in different groups（±SD）（n=8）

Note：compared with NC group：△△ P＜0.01 compared with EC group：** P＜0.01

3.3 6周递增负荷过度训练后大鼠血液各指标的相关分析

3.3.1 血液淋巴细胞的Tail length、Tail moment和Olive moment与血清MDA含量显著正相关（P＜0.01）。

3.3.2 血液淋巴细胞的Tail length、Tail moment和Olive moment与血清SOD活性显著负相关（P＜0.01）。

3.3.3 血液淋巴细胞的Tail length、Tail moment和Olive moment与血清GSH-Px活性显著负相关（P＜0.01）（见table 3）。

Table 3 Correlation analyse of the parameters

Note：** Correlation is significant at the 0.01 level（2-tailed）

4分析与讨论

运动与免疫之间的关系是许多研究人员关注的一个热点问题，运动可以引起机体免疫功能发生改变，早在1893年就有学者发现在运动后出现白细胞增多的现象。目前普遍认为，适度运动可增强机体免疫功能，过度运动训练会引起机体免疫机能的下降。淋巴细胞是机体细胞免疫功能的承担者，是机体免疫反应的重要调节细胞，其功能活性的变化直接关系到机体细胞免疫功能的强弱。从已有的研究结果分析，淋巴细胞免疫功能状态与运动存在着某种内在的联系，认识运动状态，包括过度训练状态下淋巴细胞免疫机能的变化规律对于揭示运动对机体细胞免疫机能的影响具有重要的理论和实践意义。

4.1 过度训练对大鼠血液淋巴细胞DNA的影响

淋巴细胞是机体内非常活跃的细胞，其正常免疫应答功能有赖于细胞膜的完整性和DNA的正确表达。氧自由基通过脂质过氧化损伤细胞膜和DNA，可使淋巴细胞失去正常的免疫应答机能。减少氧自由基对淋巴细胞的损伤，对增强机体的防御能力、减少疾病的发生有重要意义。

运动造成的细胞DNA损伤与运动强度、运动方式等有关。Sato Y发现适度的运动可以降低血液白细胞中DNA氧化损伤产物8-羟基-2'脱氧鸟苷酸（8-hydroxy-deoxyguanosine，8-OHdG）的水平。Mastaloudis A等发现在50 km马拉松跑跑中，外周循环血液白细胞DNA损伤的百分比显著增加，运动后两小时可以恢复，说明耐力训练可导致非持续性的DNA损伤。Tsai K等采用马拉松跑作为大运动量的有氧训练模型，他们研究发现：外周有免疫活性的细胞有显著的不可修复的DNA损伤。除了尿中的8-羟基-2'脱氧鸟苷酸有一个平行增加之外，氧化的DNA损伤和脂质过氧化代谢物显著相关，并且损伤程度持续到训练后一周。

本实验发现：6周递增负荷过度训练后，与正常对照组相比，运动对照组大鼠血液淋巴细胞DNA损伤的反映指标 Tail length、Tail moment和Olive moment显著增加，且与血清MDA含量显著正相关，与血清SOD、GSH-Px活性显著负相关。其原因可能是：过度训练后，机体自由基大量产生，超过SOD、GSH-Px的防御能力，自由基可以攻击DNA分子，表现为DNA分子的碱基修饰、DNA单/双链的断裂等。H2 O2、O2-·虽然不会直接作用于DNA，但O2-·通过超氧化物歧化酶（SOD）的作用可产生H2 O2，当H2 O2 不能被及时清除时，H2 O2 可进一步反应产生活性更高的OH·，OH·中极为活泼的单电子，容易与亲核性的DNA分子结合，OH·可与脱氧核糖反应，产生核糖自由基，后者进一步使碱基从DNA上脱落下来，甚至造成DNA链断裂。脂质过氧化物可以与OH ·一样的方式造成DNA损伤。断裂的DNA链需要不断进行修复，而参与DNA修复的酶也同时会受到自由基的攻击而影响其功能的发挥。

4.2 人参茎叶皂甙对过度训练大鼠血清自由基代谢及血液淋巴细胞DNA损伤的影响

人参茎叶皂甙系从五加科人参属植物人参的茎和叶中提取的总皂甙，其对机体具有广泛的生理、药理作用，具有镇静、增强记忆、抗心衰，抗氧自由基损伤作用以及增强免疫力、抗肿瘤等作用。

人参茎叶皂甙抗自由基、抗脂质过氧化作用已被证实。本试验发现6周递增负荷过度训练后，与运动对照组相比，人参组大鼠血清MDA含量显著下降，血清SOD和GSH-Px活性显著增高，这与有关报道相一致。

有关人参茎叶皂甙对遗传物质损伤的保护作用已有报道，但对运动后淋巴细胞DNA损伤的保护作用的研究尚未见报道。本实验观察了人参茎叶皂甙对6 周递增负荷过度训练后大鼠血液淋巴细胞DNA损伤的影响，发现人参组大鼠反映血液淋巴细胞 DNA 损伤的指标：Tail length、Tail moment、Olive moment显著降低，说明人参茎叶皂甙对此运动造成的血液淋巴细胞DNA损伤起到一定的保护作用。其机制是：人参茎叶皂甙提高了血清SOD、GSH-Px的活性，减少了OH·等对DNA的直接损伤；此外，还可能与人参皂甙可诱生干扰素有关，干扰素可增强DNA的修复反应；以及人参茎叶皂甙可促进蛋白质和DNA的合成，推测可能促进了一些DNA修复必须酶的合成，增强了DNA的修复能力。

5 结论

5.1 6周递增负荷过度训练后，大鼠血液自由基生成增加，血清中SOD、GSH-Px的活性下降，不能及时消除自由基，进而产生OH·等造成血液淋巴细胞的DNA损伤，这可能是过度训练时免疫抑制的机制之一。

5.2 人参茎叶皂甙提高了血清SOD、GSH-Px的活性，减少了OH·等对DNA的直接损伤，对6周递增负荷过度训练导致的大鼠血液淋巴细胞的DNA损伤有保护作用。

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