第一章　形态观察常用技术方法

1-1　植物组织石蜡切片的制作

【实验目的】

1.掌握植物组织石蜡切片的制样方法；

2.学习观察光学显微镜下的细胞形态与结构。

【实验原理】

石蜡切片是生物形态学观察中应用最广泛的技术，样品经过固定后，用乙醇逐级脱水，再用二甲苯取代乙醇进行透明，最后通过浸蜡使样品最终包埋到纯石蜡里，经简单修块后即可进行切片。切出带有样品的蜡带经过后续的脱蜡、复水、染色后，即可使用光学显微镜观察。如果想要长期保存，还可以制成永久切片。

石蜡切片虽然步骤较为烦琐，但原理简单，切片厚度较薄，并且可以连续切片，因此，一直是植物细胞形态学常用的方法。通常良好的制样与染色方法再加上高分辨率的光学显微镜，可以观察到细胞许多细微的结构。

【试剂与器材】

一、试剂

1.固定液：

（1）FAA固定液：乙醇50mL，冰醋酸5mL，37%甲醛溶液（市售福尔马林）10mL，用水定容至100mL。Triton X-10050μL，加入Triton X-100可以增加渗透性，可根据自己的材料决定是否添加。

（2）卡诺氏（Carnoy’s）固定液：无水乙醇与冰醋酸以3:1配制，现配现用。

2.染液：

（1）1%甲苯胺蓝染液：甲苯胺蓝1g，溶于100mL水。

（2）1%番红染液：番红1g，溶于100mL80%乙醇。

（3）0.5%固绿染液：固绿0.5g，溶于100mL95%乙醇。

（4）0.5%伊红染液：伊红0.5g，溶于100mL95%乙醇。

（5）苏木精染液：将苏木精1g溶于6mL乙醇中，逐滴滴入100mL10%硫酸铝铵溶液中，充分搅拌后用纱布蒙住瓶口，于阳光直射处放置7～10d。最后加入甘油25mL和甲醇25mL，混匀。染液配制好后，静置1～2个月，待其氧化成熟变成深紫色后，过滤使用，可长期保存。

3.甘油蛋白粘片剂：蛋白50mL，甘油50mL，水杨酸钠（防腐剂）1g。

配制方法如下：将一个鸡蛋去除蛋黄，只留下蛋白，用玻璃棒快速搅拌成雪花状泡沫，然后4℃下，用双层纱布过滤到小烧杯中，此步骤较慢，需经数小时或过夜，滤出的透明蛋白液加入等量的甘油，稍稍振摇使两者混合，然后加入水杨酸钠用于防腐。在4℃可保存几个月。

4.无水乙醇（分析纯），二甲苯（分析纯），切片石蜡，中性树胶，多聚赖氨酸。

二、器材

真空泵，切片机，展片台，蜡台，电热恒温箱，光学显微镜，刀片，镊子，烧杯，染色缸，载玻片，盖玻片，解剖针等。

【实验步骤】

一、取材与固定

用于石蜡切片的样品大小限制较为宽泛，但最好体积控制在5mm×5mm×2mm以内。取样要快，刀片要锋利。取样后，要将组织材料尽快固定。通常采用的固定液有FAA固定液、卡诺氏（Carnoy’s）固定液等。

FAA固定液又称万能固定液，在植物细胞形态学研究领域应用最广泛。其固定效果很好。固定时间较为宽泛，从24h到数月皆可。由于FAA固定液本身乙醇浓度为50%，所以材料固定后，脱水步骤可直接从50%乙醇开始。

卡诺氏固定液渗透力较强。常用于固定根尖和花药，对细胞分裂时期染色体的固定较好。但固定时间不宜过长。

对于植物材料，由于细胞壁和液泡阻碍固定液迅速渗入，一般需用真空泵抽气2～4h。抽气时间因样品幼嫩程度而异，一般判断标准是恢复到正常大气压后，样品能沉入固定液底部即可，并4℃充分固定过夜。

二、脱水

使用梯度浓度的乙醇置换样品中的水分。一般按照如下梯度和时间处理：

50%乙醇30min→70%乙醇30min→85%乙醇30min→95%乙醇30min，最后在无水乙醇中脱水3次，每次30min。脱水时间也因样品幼嫩程度而异，可适当进行调整。

三、透明

由于二甲苯既能与乙醇互溶，也能与石蜡互溶，因而常用在脱水与浸蜡之间，并且二甲苯具有透明材料的效果。一般将已经脱水的样品放入二甲苯和无水乙醇以1:1混合的混合液中处理1h，再换成纯二甲苯透明3次，每次1h。

四、浸蜡

将保存在纯二甲苯中的样品转移至二甲苯和融化石蜡以1:1混合的混合液中（也可以直接在保存于二甲苯的样品中加入与二甲苯等体积的固体石蜡片，并盖在样品上），42℃浸蜡过夜。此后，将样品换新的纯石蜡浸透，并将温度升至62℃。每天换蜡2～3次，连续换3d，以最大限度除去二甲苯。

五、包埋

用干净的铜版纸叠成合适的纸槽，置于60℃蜡台上，迅速用预热的镊子夹取样品于纸槽中，倒入熔化的纯蜡液，没过样品。蜡液应具有一定高度，以防止凝固后包埋块易断折。样品要在蜡液中摆正，一般应与纸槽长边平行，可用酒精灯加热的解剖针调整样品位置。如果纸槽中要放入多个样品，样品间最好预留8～10mm的距离以方便后续的修块与固定。待纸槽表面的蜡液凝固后，将蜡台关闭降温，小心拿出纸槽并置于室温冷却，或放入水中冷却。

六、修块与切片

切片之前，要将包住石蜡块的纸槽撕去，并根据样品的位置用刀片修块，蜡块要修成正方形或梯形，样品周围应保留1～2mm宽的石蜡，顶部应修水平。注意：样品底部也应保留部分石蜡，以便于在木块上固定。对于较为细长的样品，周围应保留更宽的石蜡，以防切片时断裂。切片时，将样品垂直对准刀片，根据所需的切片厚度进行调整，切片。用镊子小心夹取蜡带一端，根据连续切出的蜡带，逐渐伸展，并放在干净的纸上。依次按照此方法，并记住顺序，便可得到连续的蜡带。

七、展片与烤片

载玻片需要事先涂上薄薄一层甘油蛋白或者多聚赖氨酸作为粘片剂，待干燥后，滴上适当的水，将蜡带切成合适的大小，按顺序伸展在载玻片上。并放置在37℃展片台上将水分蒸干。待切片干燥后，再直立摆放在切片盒中，置于37℃温箱中干燥过夜。

八、脱蜡与复水

干燥后的蜡带需要脱蜡复水后才能进行染色。将载有蜡带的载玻片整齐摆放于染缸中，按照下列步骤进行逐级脱蜡与复水：

纯二甲苯15min（脱蜡时间可根据蜡带的厚度适当地调整）→1/2二甲苯+1/2乙醇5min→无水乙醇2min→无水乙醇2min→95%乙醇2min→80%乙醇2min→70%乙醇5min→50%乙醇5min→30%乙醇5min→水5min。

九、染色观察

根据不同的观察目的，细胞可以采用多种染色方法。简单介绍如下：

1.1%甲苯胺蓝染色：可以对全细胞进行染色。将切片用染液染色1～10min，用水洗去残色，干燥后，即可进行镜检。

2.番红-固绿染色：适用于植物根、茎、叶等组织的染色，可将木质化的细胞壁以及细胞核染成红色，细胞质染成绿色。这种染色方法不需要复水，在前面“脱蜡与复水”步骤中用80%乙醇进行处理后，即将切片置于1%番红染液中染色过夜，然后用80%乙醇脱色5min，再用1%固绿染液染色10s，之后直接进入“永久切片制作”环节，从95%乙醇处理开始，完成剩余的步骤制成永久切片。

3.苏木精-伊红（HE）染色：可将细胞核染成蓝色，细胞质染成红色。将切片用苏木精染色5～8min后，用水洗去残色，并用0.1%盐酸分色数秒，直至镜检显示细胞核颜色褪为浅红色后，用水洗去盐酸，继续进行第十步，但在进行后续第十步“永久切片制作”用95%乙醇处理之前，用0.5%伊红染液染色数秒钟，再继续进行剩余的步骤。

十、永久切片制作

在完成染色镜检后，如需长期保存切片，可以再次进行脱水、透明，然后用中性树胶封片。制作过程按照下列步骤进行：

水15s→30%乙醇15s→50%乙醇15s→70%乙醇15s→80%乙醇15s→95%乙醇15s→无水乙醇15s→无水乙醇15s→1/2二甲苯+1/2乙醇15s→纯二甲苯15s。

脱水透明完毕后，用滤纸吸去多余的二甲苯，在样品上滴加一滴中性树胶，从一侧轻轻加上一片干净的盖玻片至完全盖住样品，并注意不要产生气泡。通风处放置约数天，等待树脂凝固即可进行观察照相。

【结果与分析】

【注意事项】

1.二甲苯有毒性，涉及二甲苯的操作请于通风橱中进行。

2.蜡带脱蜡以及脱水时间因样品而异，最好先进行不同处理时间的预实验，摸索出最佳条件。

【参考文献】

1.贺学礼.2004.植物学实验实习指导.北京：高等教育出版社.

2.李景原，王太霞.2007.植物学实验技术.北京：科学出版社.

3.叶创兴，冯虎元.2006.植物学实验指导.北京：清华大学出版社.