第三节　色谱技术

色谱，也称为层析，是根据混合物中溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。其中互不相溶的两相中一相为固定相，通常为表面积很大的固体或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。色谱法是近50年来研究开发的用以分离酶等生物活性蛋白质以及多肽、核酸、多糖等生物大分子物质的一种新技术，其分离效率高、设备简单、操作方便、条件温和、不易造成物质变性，所以普遍应用于物质成分的定量分析与检测以及生物物质的制备分离和纯化过程中；其不足之处是处理量较小，操作周期长，不能连续操作，所以主要应用于实验室中。

一、色谱技术分类

色谱技术根据流动相的物态不同可以分为气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法。气相色谱法分离效果很好，但仅用于能气化的物质。生物物质一般存在于水溶液中，其分离一般采用液相色谱法。根据固定相的形状不同，色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法。根据分离的机理，色谱法可以分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法和亲和色谱法。

工业规模的色谱分离大多采用柱色谱分离法，而且吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱和亲和色谱等都可在柱中进行，其操作方法和实验装置也较为相似，而纸色谱和薄层色谱主要用于分析，所以本章主要对柱色谱进行讨论。

二、柱色谱装置和操作

1.柱色谱装置

柱色谱装置一般由进样器、色谱柱、检测器、记录仪及部分收集器等部分组成（见图1-2），其中色谱柱是色谱分离的心脏。为了方便观察色带的移动情况，色谱柱通常选用玻璃柱。工业上的大型色谱柱可以用金属制造，有时在柱壁嵌一条玻璃或有机玻璃狭带，便于观察。柱的入口端有进料分布器使进入柱内的流动相分布均匀。柱的分离效率与柱高度成正比，与直径成反比，因此层析柱多是细长型，一般L/D值为20～30，也有的小于10，如离子交换色谱柱。检测器用于检测流经色谱柱的样品，其可同时检测多个波长，也可只检测一个波长。记录仪用于记录检测器所检测的信号变化，部分收集器用来收集色谱柱中流出的样品，可按体积、时间等不同方法分管收集。

2.柱色谱操作

（1）装柱　根据欲分离物质的性质选择适宜的色谱介质，如欲进行吸附色谱，则所用介质为氧化铝、硅胶等；若欲进行离子交换色谱，则选用某一聚合物树脂作为色谱介质。装柱时，将洗脱剂与一部分缓冲液调成浆料后边搅拌边慢慢加入，一次加完。然后用几倍床体积的缓冲液平衡色谱柱。

（2）加样　将平衡后的色谱柱从柱顶部（顺上柱）或柱底部（逆上柱）进样，实验室中采用顺上柱法较普遍。

（3）洗涤　用与前组成相同的缓冲液流经色谱柱，将未与固定相结合的杂质洗涤下来。

（4）洗脱　根据目的物的性质，选用一定组成的洗脱液将目的物洗脱下来。色谱的洗脱方法有三种：恒定洗脱法（洗脱液的组成在洗脱过程中自始至终不变）；逐次洗脱法（洗脱液的组成至少改变一次）；梯度洗脱法（洗脱液的组成连续改变）。

（5）再生　目的物洗脱下来后，洗脱液成分及杂质被吸附在色谱柱中，要进行再生后才能继续使用。

三、吸附色谱

吸附色谱是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合液中各组分相互分离的方法。常用的吸附剂包括硅藻土、氧化钙、磷酸钙、羟基磷灰石、纤维素磷酸钙凝胶、白土类纤维素、淀粉、活性炭等。在吸附色谱中，溶质在色谱柱中的移动情况常以阻滞因数Rf来表示，Rf是在层析系统中溶质的移动速度和流动相的移动速度之比，Rf=溶质的移动速度/流动相的移动速度=溶质的移动距离/同一时间内溶剂前沿的移动距离。

Rf越大，表明溶质与固定相间的吸附力越小，其越易分配于流动相中，当混合物从色谱柱顶端注入时，其最先流出色谱柱；Rf越小，表明溶质与固定相间的吸附力越大，用流动相对其进行洗脱时，其最晚流出色谱柱。

四、凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱亦称凝胶过滤层析，它是以凝胶为固定相，根据各物质分子大小的不同而进行分离的色谱技术，因而又称为分子筛色谱、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱。与其他分离方法相比，其具有以下优点：凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，所以分离条件温和、样品回收率高、实验的重复性好；应用范围广，分离分子量的覆盖面大；设备简单、易于操作、色谱柱不需再生即可反复使用。因此，在生物大分子的分离纯化过程中，凝胶过滤色谱被广泛应用。

1.凝胶过滤色谱的分离机理

凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同的分子流动产生不同的阻滞作用。如图1-3所示，当含有大小不同分子的混合液加入色谱柱顶端后，大分子溶质由于直径较大，不能进入凝胶颗粒的微孔中，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。

2.表征凝胶特性的参数

表征凝胶特性的参数主要有以下各项。

（1）排阻极限和渗入限　排阻极限指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的分子量，不同型号的凝胶具有不同的排阻极限。渗入限是指能自由进出孔径的最大分子的分子量。

（2）分级分离范围　分级分离范围即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的分子量范围。其表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3000～70000。

（3）溶胀率和床体积　干燥的凝胶颗粒在使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数称为溶胀率，而其溶胀后所占有的体积即为床体积。通过床体积可以估算装满一定体积的凝胶柱所需干燥凝胶的量。

（4）凝胶颗粒大小　球形颗粒的大小通常以目数表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是100～200目。

（5）空隙体积　指色谱柱中凝胶颗粒与颗粒之间的体积，即V0值，可用分子量大于排阻极限的溶质测定，如分子量为2000的蓝色葡聚糖。

3.凝胶的种类和性质

（1）葡聚糖凝胶　应用最广泛的一类凝胶，商品名为Sephadex，由葡聚糖与环氧氯丙烷在碱性条件下交联而成。主要型号是G-10～G-200，数字是凝胶的吸水量（每克干胶膨胀时吸水毫升数）的10倍。如Sephadex G-10表示每克干胶吸水量为1mL。Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀。Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100℃下40min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。在盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都比较稳定。

（2）聚丙烯酰胺凝胶　聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺与亚甲基（甲叉）双丙烯酰胺交联而成的，商品名为Bio-Gel P。主要型号有Bio-Gel P-2～Bio-Gel P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。聚丙烯酰胺凝胶的化学稳定性较好，在pH为1～10之间的条件下比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，所以吸附效应较小。另外，聚丙烯酰胺凝胶不会像葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。

（3）琼脂糖凝胶　琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，是由D-半乳糖和3，6-脱水半乳糖交替构成的多糖链。其商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有Sepharose（2B-6B）和Bio-gel A。琼脂糖凝胶在pH为4～9的条件下是稳定的，它在室温下比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶稳定。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以0～30℃为宜。

（4）其他　多孔玻璃珠和多孔硅胶等。

4.凝胶色谱的应用

（1）脱盐及去除小分子杂质和溶液的浓缩　含盐或其他小分子杂质的蛋白质溶液在通过凝胶色谱柱时，低分子量的盐或小分子杂质因进入凝胶颗粒内部，所以移动速度减慢；而大分子量的蛋白质则随流动相较快地通过凝胶粒而获得分离。

（2）浓缩　利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。

（3）生物大分子的纯化及生化药物中热原物质的去除　通常情况下，物质的大小与其分子量成正比。当不同组分的混合物流经色谱柱时，分子量大的物质不能进入凝胶颗粒内部，只能在凝胶颗粒的间隙内移动，所以其行程短，先流出色谱柱；而小分子因能进入凝胶颗粒内部，所以后流出色谱柱。这样，分子的大小不同使其流出色谱柱的时间不同，从而使不同分子量的物质相互分开。热原物质是微生物产生的能够致热的某些多糖蛋白复合物等，它们是一类分子量很大的物质，注射液中含有热原可危及病人的生命，用凝胶过滤法可方便地去除热原。如用Sephadex G-25凝胶柱色谱可有效地去除氨基酸中的热原性物质。

（4）分子量测定　分子量不同的蛋白质流经色谱柱时，在一定的范围内，各个组分的洗脱体积Ve与其分子量的对数呈线性关系：

Ve=-b' lgMr+c'

因此，通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶色谱测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响，且要求所测蛋白质基本上是球形的。

五、离子交换色谱

离子交换色谱是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的方法。离子交换剂最常用的形式是离子交换树脂，它是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的网状结构的高分子聚合物，由不溶性的树脂骨架、与骨架相连的功能基团及与功能基团所带电荷相反的平衡离子三部分所组成。其中平衡离子也叫活性离子，其决定树脂的主要性能。如果活性离子是阳离子，此树脂就会和溶液中的阳离子发生交换，此树脂就称为阳离子交换树脂；如果活性离子是阴离子的就称为阴离子交换树脂。

1.离子交换树脂的分类

常见的离子交换树脂分为大网格树脂、凝胶型树脂、均孔树脂、离子交换纤维素和葡聚糖凝胶离子交换剂等。各种交换树脂均可按照其可解离的交换基团分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。

根据活性基团酸性的强弱或碱性的强弱不同，阳离子交换树脂又可分为强酸性阳离子交换树脂和弱酸性阳离子交换树脂，阴离子交换树脂又可分为强碱性阴离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂。

2.离子交换树脂的性能评价

不同的树脂其交换能力大小不同，表征树脂交换能力大小的主要参数是交换容量，即单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。对于阳离子交换树脂可以将其用盐酸处理成氢型后用NaOH溶液测定，而对于阴离子交换树脂则是将其转换成氯型后测其交换容量。除此之外，滴定曲线也是检验和测定离子交换剂性能的重要数据，如图1-4是几种典型离子交换剂的滴定曲线。

强酸或强碱型离子交换树脂的滴定曲线开始是水平的，到某一点即突然升高或降低，表明该点交换剂上的离子交换基团已被碱或酸完全饱和；而弱酸或弱碱型的交换剂的滴定曲线则无水平部分，其是逐渐上升或下降的。通常情况下利用滴定曲线的转折点可以估算出交换剂的交换容量，由转折点的数目可推算不同离子交换基团的数目。滴定曲线还表示交换容量随pH的变化。

除此之外，表征离子交换树脂性能的参数还有树脂的外观、稳定性、交联度、膨胀度等。

3.离子交换色谱操作

进行离子交换色谱操作时，先将树脂用洗脱剂（即流动相）处理，使树脂转变为洗脱剂离子的形式，然后将溶解在少量溶剂中的试样加到色谱柱的上部，再用洗脱剂洗脱，流出液分部收集，测定其含量。

对于蛋白质等两性电解质，其在两相中的分配系数对离子强度的变化非常敏感，离子强度的微小变化就会引起分配系数的很大变化，且不同蛋白质其分配系数可能相差特别大，因此，离子交换树脂上被吸附物质的洗脱，很少采用恒定洗脱法，而多采用线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。线性梯度洗脱中，需要梯度混合仪等调配浓度梯度的设备使流动相的离子强度线性增大，此时溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大。在逐次洗脱中，流动相的离子强度阶跃增大，所以不需特殊的梯度设备，只需将不同盐浓度的流动相溶液进行切换即可，此时，溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段式的。此法虽操作较简单，但若对预分离混合物的性质了解不够清除，易出现多组分洗脱峰重叠的现象。因此在实际操作中，若料液组成未知，一般应首先采用线性梯度洗脱，确定各组分的分配特性及色谱操作的条件。

六、亲和色谱

1.原理

亲和色谱是利用固定相的配基与生物分子间特殊的生物亲和力的不同而进行分离的一种色谱技术。如抗原-抗体、酶-底物或抑制剂、激素-受体等之间的相互作用。此种作用为生物亲和作用，专一性很强，因此，亲和色谱具有高度的选择性，广泛用于酶、抗体、核酸、激素等生物大分子及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。尤其是对混合物中含量极少而又不稳定的物质的分离极为有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。但是，并不是任何生物高分子都有与其专一性结合的配基，所以此种分离方法也有一定的局限性。

2.亲和吸附剂的制备

亲和色谱是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的色谱技术，在生物分离中有广泛的应用。选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和色谱的关键步骤之一。亲和吸附剂的制备包括载体和配基的选择、载体的活化、配基与载体的偶联。常用的亲和色谱载体主要有多孔玻璃、聚丙烯酰胺、纤维素载体、葡聚糖、琼脂糖、交联聚苯乙烯等。配基是具有特异亲和力的一对分子中的任何一方，在亲和色谱分离中，经常被采用的生物亲和关系如酶与底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；抗体与抗原、病毒、细胞；激素与受体蛋白；核酸与组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；细胞与细胞表面特异蛋白、外源凝集素等。但是，载体由于其相对的惰性，往往不能直接与配基连接，偶联前一般需要经过高碘酸氧化法、溴化氰活化法、甲苯磺酰氯法等活化后才能与所采用配基相偶联制成相应的亲和吸附剂。

3.亲和色谱的操作

亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作相同（见图1-5）。将特异性相互作用的分子对中的一种用化学方法固定到亲水性多孔固体介质上，装入色谱柱中，用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡，含有目标产物的料液连续通入色谱柱，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白，最后用可使目标产物与配基解离的洗脱液洗脱目标产物，得到纯化的目标产物，亲和色谱洗脱曲线如图1-6所示。

4.亲和色谱的应用

亲和色谱是利用物质间的特异亲和力的不同来对生物活性物质进行分离的，所以其特异性强。其对目的产物的洗脱是通过变换洗脱液的pH、离子强度或改换洗脱液的成分为与目的产物或配基有亲和作用的小分子化合物等措施来实现的，所以分离条件温和、分离速度快，分离效果好，且其对设备要求不高，因而多种生物分子的分离与纯化均用此法，如干扰素、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）等的纯化。

干扰素是一类生理活性蛋白质，对癌症、肝炎等疾病具有很好的疗效，可通过动物细胞培养或重组DNA大肠杆菌发酵大量生产，但细胞在诱导后能产生许多种蛋白质，而干扰素仅占其中很小的一部分，所以其含量很低，提纯十分困难。1976年Davey利用植物凝集素伴刀豆球蛋白A与琼脂糖凝胶偶联而成的吸附剂为分离介质，利用亲和色谱对其进行分离纯化，经过一次分离即把粗品提纯了3000倍，活力回收达89%。固定化金属离子亲和色谱和免疫亲和色谱也可用于干扰素的纯化。如以破碎细胞抽提液的硫酸铵沉淀活性部分为出发原料，利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大肠杆菌的重组人白细胞干扰素，经一步单抗免疫亲和色谱，干扰素的比活提高了1150倍，收率高达95%。

除此之外，由于酶与辅酶及其抑制剂、抗体与抗原、激素与受体蛋白等物质间的生物亲和作用，亲和色谱还较多应用在醇脱氢酶、磷酸果糖激酶、α-淀粉酶抑制剂、白细胞介素、集落刺激因子、胰岛素、绒毛生长激素等活性物质的纯化方面。