第五节　电泳

一、电泳的原理与分类

电泳是荷电溶质在电场作用下发生定向泳动的现象。许多重要的生化药物，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在一定的pH下可以带正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳分离是利用电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。

电泳分离的原理和操作形式多种多样，主要有区带电泳、等电点电泳和等速电泳等。电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳是将凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，然后将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。

二、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接的β-D吡喃半乳糖和1，4连接的3，6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的；琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，其由预分离物质的分子量大小来决定，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径，表1-6是凝胶浓度与待分离的DNA碱基对间的关系。

琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析，尤其适合于核酸的提纯、分析。电泳操作时，把DNA样品加入到制备好的琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度主要取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同、而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。在凝胶中加入少量溴化乙锭（ethidium bromide，EB），其分子可插入DNA的碱基之间形成一种复合物，此复合物在254～365nm波长紫外光照射下呈橘红色荧光，因此可对分离的DNA进行检测。如图1-8为一典型的琼脂糖凝胶电泳图谱。

琼脂糖凝胶电泳作为核酸的提纯、分析的主要手段，其优点如下。

① 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

② 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%～99%），近似自由电泳，样品扩散较自由，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

③ 琼脂糖透明，无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

④ 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和亚甲基（甲叉）双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合而成，PAGE主要用于蛋白质等生物物质的制备分离。蛋白质混合样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳以后，被分离的各蛋白质组分因所带的净电荷以及分子大小和形状等互不相同，其电泳迁移率不同，从而达到相互分离。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化。可以根据待分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。例如，7.5%的聚丙烯酰胺凝胶孔径较小，适用于分子量为10～1000kD的溶质的分级分离；3.5%的丙烯酰胺凝胶孔径较大，适用于分子量为1000～5000kD的溶质的分级分离；相对分子质量更大的溶质需采用孔径更大的凝胶，如丙烯酰胺与琼脂糖的混合凝胶，或纯琼脂糖凝胶。表1-7为凝胶浓度与待分离物质的分子量的关系。在一般情况下，大多数生物体内的蛋白质采用7.5%浓度的凝胶，所得电泳结果往往是满意的，因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝胶”。

聚丙烯酰胺凝胶电泳时带有电荷的分子在电场作用下发生移动，移动的速度依赖于电场的强度、分子的净电荷以及分子的大小和形状，同时也取决于介质的离子强度、黏度和温度。由于聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛效应，用它作为电泳支持物，把分子筛效应和电荷效应结合起来，可达到更高的灵敏度。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类。前者指整个电泳系统中所用缓冲液、pH和凝胶网孔都是相同的，由于缺少浓缩胶，蛋白质电泳条带会变宽，而且分辨率差。不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成，上层凝胶称为浓缩层或堆积层，其浓度较低，孔径较大，凝胶对溶质的泳动有阻滞作用，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶为分离胶，其凝胶浓度较高，各组分根据荷电量、分子大小及形状的不同得到分离。不连续凝胶电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH和孔径，其能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。

四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基磺酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是在有强还原剂（如巯基乙醇）存在的情况下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合，从而形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS复合物。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质亚基-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，其在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而仅取决于亚基分子量的大小（图1-9）。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳因易于操作和广泛的用途，使它成为蛋白质研究领域中的一种重要的分析技术。电泳操作的步骤跟前面的几种电泳一样，首先是根据欲分离蛋白质的分子量大小制得一定浓度的凝胶，当然，为了分离效果更好一些，一般制成不连续凝胶，即下层分离胶，上层浓缩胶，凝胶制好后将经过处理的样品加至加样孔中进行电泳，电泳至样品中加入的溴酚蓝的前沿迁移至凝胶底部即结束，最后是将凝胶进行染色和观察。通常是用考马斯亮蓝R-250进行染色；若蛋白质含量很低，可用灵敏度更高的银染色进行染色观察。图1-10、图1-11分别是考马斯亮蓝染色电泳凝胶和银染色电泳凝胶。

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可对蛋白质进行分离和纯度鉴定，而且可以根据电泳迁移率大小测定蛋白质的分子量。蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可得到一条标准曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量。图1-12是一典型的利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质进行分离和分子量测定的电泳图谱，将分子量标准（marker）与样品放在同一块凝胶上进行电泳操作，使聚合、染色、脱色具有一致性，极大程度上减轻了操作条件等外部因素的影响，使结果更准确可靠。

利用此法测分子量时，根据所测蛋白质分子量不同，选用的分子量标准也不同，通常有小分子量标准、低分子量标准、高分子量标准等不同规格。表1-8为常用的低分子量标准蛋白质。

五、等电聚焦

一般区带电泳利用溶质迁移率的差别来进行分离，而等电聚焦利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，其在等电点的pH下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离（图1-13）。

等电聚焦操作的关键是调配稳定的连续pH梯度，一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸的缓冲液调配pH梯度，前者形成的pH梯度稳定性较差，而后者的聚合物（也称为载体两性电解质）含有许多正负电荷，缓冲能力强，形成的pH梯度较稳定，所以应用更广泛些。电泳操作时，在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子或其他两性分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。图1-14是载体两性电解质在电场中形成pH梯度的模式图。

在等电聚焦中，分离仅仅决定于蛋白质等的等电点，这是一个“稳态”过程。一旦蛋白质达到它的等电点位置，没有净电荷，就不能进一步迁移。如果蛋白带向阴极扩散，则将进入高pH范围而带负电，阳极就将吸引它回去，直到它回到净电荷是零的位置。如果它向阳极扩散，则将带正电，阴极将吸引它回去，直到它回到净电荷是零的位置。因此蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带。此“聚焦效应”可消除分子扩散引起的分离度下降。

等电聚焦电泳中，分辨率可达0.01pH单位，所以此法特别适合于分子量相近而等电点不同的蛋白质或氨基酸的分离。