第一节　氨基酸类药物制备的方法

一、氨基酸粗品的制备

生产氨基酸的常用方法有蛋白质水解提取法、微生物发酵法、酶合成法和化学合成法。通常将直接发酵法和微生物转化法统称为发酵法；现在除少数几种氨基酸用蛋白质水解提取法生产外，多数氨基酸都采用发酵法生产，也有几种氨基酸采用酶法和化学合成法生产。

1.蛋白水解提取法

该方法以毛发、血粉、废蚕丝等为原料，通过酸、碱或蛋白水解酶水解成氨基酸混合物，经分离纯化获得各种氨基酸。水解法生产氨基酸主要分为分离、精制、结晶三个步骤。

本法的优点是原料来源丰富，投产比较容易。缺点是产量低，成本较高。目前仍有一定数量的品种如胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸等用水解提取法生产。

（1）酸水解法　一般是在蛋白质原料中加入约4倍质量的6mol/L盐酸或8mol/L硫酸，于110℃加热回流16～24h，或加压下于120℃水解12h，使氨基酸充分析出，除酸即得氨基酸混合物。本法的优点是水解完全，水解过程不引起氨基酸发生旋光异构作用，所得氨基酸均为L-型氨基酸。缺点是营养价值较高的色氨酸几乎全部被破坏，含羟基的丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，水解产物可与醛基化合物作用生成一类黑色物质而使水解液呈黑色，需进行脱色处理。

（2）碱水解法　通常是在蛋白质原料中加入6mol/L氢氧化钠或4mol/L氢氧化钡，于100℃水解6h，得氨基酸混合物。本法的优点是水解时间较短，色氨酸不被破坏，水解液清亮。缺点是含羟基和巯基的氨基酸大部分被破坏，引起氨基酸的消旋作用，产物有D-型氨基酸，故本法较少采用。

（3）酶水解法　通常是利用胰酶、胰浆或微生物蛋白酶等，在常温下水解蛋白质制备氨基酸。本法的优点是反应条件温和，氨基酸不被破坏也不发生消旋作用，所需设备简单，无环境污染。缺点是蛋白质水解不彻底，中间产物较多，水解时间长，故主要用于生产水解蛋白和蛋白胨，在氨基酸生产上比较少用。

2.微生物发酵法

发酵法是指以糖为碳源，以氨或尿素为氮源，通过微生物的发酵繁殖，直接生产氨基酸，或是利用菌体的酶系，加入前体物质合成特定氨基酸的方法。其基本过程包括菌种的培养、接种发酵、产品提取及分离纯化等。所用菌种主要为细菌、酵母菌。随着生物工程技术的不断发展，采用细胞融合技术及基因重组技术改造微生物细胞，已获得多种高产氨基酸杂种菌株及基因工程菌，其中苏氨酸和色氨酸基因工程菌已投入工业生产。有目的地培养产率高的新菌种，是发酵法生产氨基酸的关键。目前大部分氨基酸可通过发酵法生产，如谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸等，产量和品种逐年增加。

本法的优点是直接生产L-型氨基酸，原料丰富，以廉价碳源如甜菜或化工原料（乙酸、甲醇、石蜡）代替葡萄糖，成本大为降低。缺点是产物浓度低，生产周期长，设备投资大，有副反应，单晶体氨基酸的分离比较复杂。

3.化学合成法

化学合成法是利用有机合成和化学工程相结合的技术生产氨基酸的方法。通常是以α-卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐、乙酰氨基丙二酸二乙酯、卤代烃、α-酮酸及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩合、取代、加氢等化学反应合成α-氨基酸。化学合成法是制备氨基酸的重要途径之一，但氨基酸种类较多，结构各异，故不同氨基酸的合成方法也不同。

本法的优点是可采用多种原料和多种工艺路线，特别是以石油化工产品为原料时，成本较低，生产规模大，适合工业化生产，产品易分离纯化。缺点是生产工艺复杂，生产的氨基酸皆为DL-型消旋体，需经拆分才能得到L-型氨基酸。目前多用固定化酶拆分DL-型氨基酸，具有收率高、成本低、周期短的优点，促进了化学合成法的发展。蛋氨酸、甘氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸等多用化学合成法生产。

4.酶合成法

酶合成法也称酶工程技术、酶转化法，是指在特定酶的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸的技术。它是在化学合成法和发酵法的基础上发展建立的一种新的生产工艺，其基本过程是以化学合成的、生物合成的或天然存在的氨基酸前体为原料，将含特定酶的微生物、植物或动物细胞进行固定化处理，通过酶促反应制备氨基酸。固定化酶和固定化细胞等技术的迅速发展，促进了酶合成法在实际生产中的应用。

本法的优点是产物浓度高，副产物少，成本低，周期短，收率高，固定化酶或细胞可连续反复使用，节省能源。生产的品种有天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、异亮氨酸等。

二、氨基酸的分离

氨基酸的分离是指从氨基酸混合液中获得某种单一氨基酸产品的工艺过程，是氨基酸生产技术中重要的环节。氨基酸的分离方法较多，下面介绍几种常用的方法。

1.溶解度或等电点法

溶解度法是根据不同氨基酸在水和乙醇等溶剂中的溶解度不同，而将氨基酸彼此分离。如胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸溶解度较大，而胱氨酸则无多大差别，故可将混合物中的胱氨酸、酪氨酸与其他氨基酸分开。

各种氨基酸在等电点时溶解度最小，易沉淀析出，故利用溶解度法分离制备氨基酸时，常与氨基酸等电点沉淀法结合并用。

氨基酸在不同溶剂中溶解度不同这一特性，不仅用于氨基酸的一般分离纯化，还可用于氨基酸的结晶。在水中溶解度大的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸，其结晶不能用水洗涤，但可用乙醇洗涤去杂质；而在水中溶解度较小的氨基酸，其结晶可水洗去杂质。

2.特殊沉淀剂法

氨基酸可以和一些有机化合物或无机化合物生成具有特殊性质的结晶性衍生物，利用这一性质可分离纯化某些氨基酸。如精氨酸与苯甲醛生成不溶于水的苯亚甲基精氨酸沉淀，经盐酸水解除去苯甲醛，即可得纯净的精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻二甲苯-4-磺酸反应，生成亮氨酸磺酸盐沉淀，后者与氨水反应，得游离亮氨酸；组氨酸与氯化汞作用生成组氨酸汞盐沉淀，经处理得组氨酸。

本法操作简便，针对性强，至今仍是分离制备某些氨基酸的方法。缺点是沉淀剂比较难以去除。

3.离子交换法

离子交换法是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力不同而分离纯化氨基酸的方法。氨基酸为两性电解质，在一定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，对同一种离子交换剂的吸附力也不同，故可对氨基酸混合物进行分组或单一成分的分离。例如，在pH5～6的溶液中，碱性氨基酸带正电，酸性氨基酸带负电，中性氨基酸呈电中性，选择适宜的离子交换树脂，可选择性吸附不同解离状态的氨基酸，然后用不同pH缓冲液洗脱，可把各种氨基酸分别洗脱下来。

三、氨基酸的结晶与干燥

结晶是溶质以晶体状态从溶液中析出的过程。通过上述方法分离纯化后的氨基酸仍混有少量其他氨基酸和杂质，需通过结晶或重结晶提高其纯度，即利用氨基酸在不同溶剂、不同pH介质中溶解度不同，达到进一步纯化。氨基酸结晶通常要求样品达到一定的纯度、较高的浓度，pH选择在pI附近，在低温条件下使其结晶析出。氨基酸结晶通过干燥进一步除去水分或溶剂获得干燥制品，便于使用和保存。常用的干燥方法有常压干燥、减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

四、氨基酸类药物的检测

各种氨基酸理化性质不同，检测方法也不同，但一般是以甲酸∶冰醋酸按比例混合，采用电位滴定法、高氯酸溶液滴定等。