酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原－抗体免疫学反应敏感性的一种标记免疫技术。在受检标本中最好不存在与标记酶相同的酶。

酶联免疫吸附法（ELISA）是目前临床上应用最广泛的技术。ELISA既可用于测定抗原，也可用于测定抗体。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：

适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，如对患者血清中病毒蛋白抗原进行检测。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

间接法是检测抗体常用的方法。原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）检测与固相抗原结合的受检抗体。一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。

传染病的早期诊断常依赖于IgM抗体的检测，多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM呈正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。

ABS为亲和素（avidin）生物素（biotin）系统的缩写。用化学方法制成的衍生物素－羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法结合起来，可分为酶标记亲和素－生物素（LAB）法和桥联亲和素－生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS－ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS－ELISA应用不多。

ELISA技术要点包括试剂制备、反应条件和标准化操作。实验过程中任何一个方面的欠缺或疏漏，都将影响实验结果。

ELISA的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体与标记酶直接关联的酶反应底物。①固相载体：可作ELISA中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。②抗原和抗体：在ELISA实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。用于ELISA的抗体有单克隆和多克隆抗体。③免疫吸附剂：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于ELISA板孔中在4℃过夜，经清洗后即可应用。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。④酶和底物：ELISA中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。ELISA中最常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和从牛肠黏膜或大肠埃希菌提取的碱性磷酸酶（ALP）。⑤结合物：酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有戊二醛交联法。

在ELISA测定时，应选择包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。要使ELISA测定得到准确的结果，无论是定性还是定量，必须严格按照规定的方法制备试剂和实施测定。主要试剂已如前述，其他试剂如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时需注意。

ELISA操作步骤多，所需试剂也多，测定的全过程应力求各个步骤操作的标准化。另外，使用洗涤机洗板不仅省时省工，也利于操作标准化，但应注意对洗板机的性能加以检定后再投入使用。

酶扩大免疫测定技术（enzymemultiplied immunoassay technique，EMIT）是最早取得实际应用的均相酶免疫测定方法。此法主要检测小分子抗原或半抗原，在药物测定应用较多。

斑点－酶联免疫吸附试验（dot－ELISA，斑点－ELISA）具有以下特点，①以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体；②底物经酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色，可直接观察结果。具体操作为：在硝酸纤维膜上用铅笔划成4mm×4mm的小格，在每格中央点加1～2μl抗原，使成为一个小点；待干燥后，将每格剪下分别放入ELISA反应板孔中，按ELISA方法操作；最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出现染色斑点，为阳性反应。若将硝酸纤维素膜裁剪成膜条，并在同一张膜条上不同位置点多种抗原，将整个膜条与同一份血清反应，可同时获得对多种疾病的诊断结果。该法的缺点是操作麻烦，特别是洗涤步骤比较烦琐。

目前用于临床检验的应用斑点－ELISA试剂包括三种类型：①将试剂膜粘贴在塑料条片上，便于洗涤和观察；②将试剂膜封在小盒内，膜下垫吸水剂，洗涤液通过膜吸入盒内，此即斑点免疫渗滤试验；③将试剂膜固定在酶标包被板中放入特殊的自动分析仪中检测。

免疫印迹法（immuno blotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法，因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southern Blot相类似，又称Western Blot。免疫印迹法分三个阶段进行。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

电转移。在低电压（100V）和大电流（1～2A）条件下，通电45分钟将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见（只有在染色后才显出条带）。

酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物。常用辣根过氧化物酶的底物为3，3′－二氨基联苯胺（呈棕色）和4－氯－1－萘酚（呈蓝紫色），阳性反应可见清晰可辨的条带。另外，还可根据SDS－PAGE加入的分子量标准，确定各组分的分子量大小。

本法结合SDS－PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个特异、有效的分析方法，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，还可用于病毒性疾病诊断。

重组免疫结合试验（recombinant immunol binding assay，RIBA）与免疫印迹法不同之处在于特异性抗原不通过电泳分离转印，而是直接分条加在固相膜上。RIBA已用于血清抗HCV抗体的测定和分析。

免疫荧光技术是将已知抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光标记的抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可利用荧光显微镜观察组织或细胞内形成的荧光素标记抗原－抗体复合物，根据荧光强度和所在位置，确定抗原或抗体的性质、定位，以及测定含量。关键技术为制备荧光素标记的抗体或抗原。

用作标记的荧光素应符合以下要求：①具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除；②荧光效率高，与蛋白质结合后仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后，不影响蛋白质原有的生化和免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

被标记的抗体或抗原要求具有高特异性和高亲和力，而且不含针对标本中正常组织的抗体或抗原。需提取、纯化后再作标记。

常用的方法有搅拌法和透析法。标记完成后，应对标记抗体或抗原进一步纯化，以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体或抗原。纯化方法可采用透析法或层析分离法。

荧光抗体或抗原在使用前应加以鉴定。鉴定内容包括抗体效价、荧光素与蛋白质的结合比率测定。抗体效价可用琼脂双扩散法进行测定，效价大于1∶16者为佳。荧光素与蛋白质结合比率（F／P）测定可先将制备的荧光抗体或抗原稀释至A280≈1.0，然后分别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算比率。

荧光抗体或抗原的保存应注意防止抗体或抗原失活以及防止荧光淬灭。最好小量分装，－20℃冻存，可放置3～4年。4℃可存放1～2年。

免疫荧光抗体技术在临床上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。在细菌学检验中主要用于菌种的鉴定。标本材料可以是培养物、感染组织、患者分泌排泄物等。本法较其他鉴定细菌的血清学方法速度快、操作简单、敏感性高，但在细菌实验诊断中，一般只能作为一种补充手段使用，而不能代替常规诊断。荧光抗体染色法对布鲁菌和炭疽杆菌等的实验诊断有较好效果。荧光间接染色法测定血清中的抗体，可用于流行病学调查和临床回顾诊断。另外，在病毒性疾病诊断中用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况，有助于诊断和治疗。在寄生虫感染诊断中，间接荧光抗体染色法有非常广泛的应用。

免疫电镜技术是将抗体进行特殊标记后，进行抗原抗体反应并用电子显微镜观察结果的一种技术。根据标记方的不同，分为铁蛋白标记、酶标记和胶体金标记免疫电镜技术。免疫电镜技术在很大程度上提高了病毒性疾病快速诊断的敏感性和特异性。

铁蛋白标记免疫技术是将含铁蛋白通过一种低分子量的双功能试剂与抗体结合，成为一种双分子复合物，它既保留抗体的免疫活性，又具有电镜下可见的高电子密度铁离子核心，因此用铁蛋白标记的抗体可通过电镜免疫化学方法在电镜下定位细胞中的抗原。由于某些固定技术如锇酸固定对抗体抗原的结合有干扰，因此应采取较为温和的样品制备方法。

铁蛋白是一种含铁约23%的蛋白质，分子量460kD，直径10～12μm。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能试剂结合成一种双分子复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，铁胶粒直径核心为55～60nm含2000～3000个铁原子，分布于四个区域形成四个圆形致密区，都具有很高的电子密度，便于电镜观察。

酶标记免疫电镜技术是利用免疫酶细胞化学技术，以酶作为抗原抗体反应的标记物，在既不改变抗原抗体的免疫反应，也不影响酶活性的条件下，与相应酶底物作用，形成一种具有高电子密度的反应产物，便于在电子显微镜下观察。辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）具有稳定性强和反应特异性高等优点，是目前应用最多的酶标记物。实验方法包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶－抗过氧化物酶技术。

胶体金标记技术是利用胶体金在碱性环境中带有负电，可与抗体相吸附而制成胶体金标记的抗体，当金标记的抗体与抗原反应后，在光镜水平胶体金液呈鲜艳的樱红色，不需另加染色液就可见；在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了可喜的进展。

胶体金标记抗体的免疫电镜技术有许多优点：首先，不需用H ₂O ₂等损伤微细结构的处理步骤，对细胞的微细结构影响较小。其次，金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易与其他免疫产物相区别。金标抗体还可加入培养液中，对培养细胞内抗原进行标记定位。由于金具有强烈的激发电子的能力，因此，不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。金标液无毒性，对人体无损伤。

发光免疫分析是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为：光照发光、生物发光、化学发光等。目前临床应用较多的是化学发光法。化学发光免疫分析使用的标记物可分为三类：

最常用的标记物主要有吖啶酯类化合物。这类标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应，并没有本底发光。吖啶酯类化合物发光是典型的瞬间发光，其化学发光分析时间很短，在加入氧化剂和pH纠正液后，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解并发光，在1秒内光子散射达到高峰，整个过程在2秒内完成。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减少所产生的光量，从而增加灵敏度。

以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法，从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析（chemiluminescent enzyme immuno assay，CLEIA）属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂。操作步骤与酶免分析完全相同：以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，它们有各自的发光底物。在这类发光反应中，采用某些酶作为标记物。这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身直接参与发光反应。

最常用的有三联吡啶钌标记物。这类标记物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体（或受体），不直接参与化学发光反应。

免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl ₄）在还原剂白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了可与蛋白质结合以外，还可以与许多其他生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于病原生物学、免疫学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金免疫技术在病原性细菌引起的疾病诊断中已显示其优越性：

谌志强等建立了大肠埃希菌0157：H7的胶体金免疫渗滤法检测。采用微波炉法制备胶体金，自制大肠埃希菌0157：H7多克隆抗体包被胶体金制备探针，通过免疫渗滤法检测大肠埃希菌0157：H7。方法简单快速，无需特殊的仪器设备，适合现场检测。大肠埃希菌0157：H7胶体金探针具有很强的特异性。

闫中强等建立了利用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心法，建立快速检测炭疽芽胞杆菌的方法，该法的检测灵敏性为1×10 ⁶cfu／ml，并能在20分钟内完成检测。

王中民等建立了一种简便快速的胶体金免疫层析法（GICA）用于检测沙门菌。将抗沙门菌多抗用抗原吸收法封闭与其他肠道杆菌的交叉反应，标记胶体金溶胶制成探针，采用多膜复合的方法制成免疫层析条。层析条灵敏度为2.1×10 ⁶cfu／ml，不与大肠埃希菌（24株）、志贺菌（27株）、枸橼酸杆菌（2株）、变形杆菌（6株）、耶尔森菌（8株）等其他肠道杆菌反应，而检测鼠伤寒沙门菌（13株）、猪霍乱沙门菌（13株）和肠炎沙门菌（5株），均得到阳性结果。37℃放置33天，检测结果无差异。