第二节　DNA提取技术

基因组DNA的有效提取是进行任何DNA下游工作的前提和基础，有效提取指的是从生物组织中得到足够量的基因组DNA（或称总DNA），而且尽可能避免降解和含有影响下一步酶反应的杂质。中药按来源可分为植物类、动物类和真菌类，利用动物新鲜的或迅速冷冻储藏的血液和组织液中提取DNA是最早建立的DNA提取方法，任何核酸实验手册中均可查到；真菌的DNA提取可参考植物的方法，因为有些真菌材料含有较多的多糖；植物材料区别于动物材料的特殊性在于：①植物有细胞壁，所以在添加DNA提取液前，要有一个细胞壁破碎过程，一般用液氮冷冻粉碎，或加石英砂共研；②植物中含有纤维素、半纤维素、果胶等多糖类化合物，它们容易与DNA共沉淀，CTAB法即是针对植物中大多含有多糖而建立的DNA提取方法；③植物中含有大量的次生代谢产物，其中严重影响DNA质量的有酚类及鞣质，还有一般方法去除不掉的多糖类化合物。中药分子鉴定所涉及的研究对象可能是新鲜材料或专为DNA研究处理过的材料，如用硅胶快速干燥的植物材料；也可能是商品药材，或经一定加工炮制过的饮片，如炮制品或粉末等。商品药材或中药饮片对于DNA提取来说主要挑战是：①材料的干燥过程缓慢，储存时间长，或还有其他加工过程，其中的DNA降解十分严重，DNA含量低，且大多已成碎片，当然随着储存时间的增加，可提取出的DNA会变少；②材料中次生代谢产物含量高；③由微生物引起的外源DNA污染严重；④有些材料比较坚硬。

在此主要介绍DNA的常规提取方法、预处理方法、次生代谢产物及其去除方法。

一、DNA的常规提取方法

1.CTAB法（Doyle和Doyle，1987）

CTAB法是目前最常用的DNA提取方法。CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）是一种去污剂，它可与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7M NaCl）中可溶解并且稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3M NaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低，而沉淀出来，而大部分的蛋白及多糖类杂质仍溶于溶液中。

主要步骤包括：

①新鲜组织或干燥组织，先置液氮中速冻，再迅速研磨使成糊状或粉状；②将糊状或粉状物转入离心管后，加入预热的CTAB缓冲液，放入56℃水浴保温，不时缓慢振摇；③取出离心管，使恢复至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），缓慢翻转离心管使内含物充分混匀后形成乳浊液，离心使分层；④重复第3步骤；⑤向离心管中加入1/10体积的10% CTAB溶液，再用氯仿/异戊醇再抽提一次；⑥向离心管中加入等体积的沉淀缓冲液，混匀，室温下放置，离心去上清部分；⑦加TE缓冲液，混匀后加2/3体积冰冷的异丙醇，-20℃放置，离心收集沉淀，在室温下自然风干；⑧将此沉淀溶于合适体积的TE缓冲液，加入1/5体积的3M NaAc（pH 6.0）和2倍体积的冰冷乙醇，在-20℃放置，离心收集沉淀；⑨加入乙醇洗沉淀，离心去除残留的无机离子，在室温下自然风干直至沉淀无醇味，溶于适量的TE缓冲液；⑩标定DNA含量，然后放入-20℃储存或放入4℃待用。

2.高盐低pH法（Guillemaut和Weil，1992）

高盐低pH法省去了一般用SDS（sodium dodecyl sulfate）去污剂提取时使用的水饱和酚抽提的繁琐步骤，除了可以去除多酚杂质外，在提取干药材DNA质量也较CTAB法为好。SDS是DNA提取最常用的去污剂，高盐低pH法的特点是使用pH 5.5的酸性介质，避免了多酚类物质的电离化和以后的进一步氧化，另外高浓度的KAc（potassium acetate）和低温处理可沉淀去除蛋白质和多糖，高盐低pH法去除多酚的效果较好，适用于多糖含量不高或其含量未超过一定限度而对进一步研究无影响的材料。

主要步骤包括：

①在新鲜叶片或干燥的叶片中加入少许65℃预热的提取缓冲液及石英砂迅速研磨后，用提取缓冲液将上述糊状物加入离心管；②放入65℃水浴保温，不时缓慢振摇；③在室温下离心，必要时上清液通过4层纱布过滤以去除固体杂质；④在上清液中加入2/3体积的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃，沉淀蛋白质；⑤在4℃下离心，弃蛋白沉淀；⑥上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）抽提，离心使分层，取出水相转入另一离心管；⑦如果中间层仍有白色沉淀，则再用氯仿/异戊醇（24∶1）抽提一次；⑧在上清液中加入2/3体积的冰冷的异丙醇，混匀后置于-20℃沉淀核酸，沉淀溶于无菌水中，离心弃不溶物；⑨重复第8步骤，收集DNA，用70%乙醇洗沉淀，在空气中干燥；⑩将DNA沉淀溶解在合适体积的TE缓冲液中，测定DNA含量后，分装存放于-20℃或4℃冰箱中待用。

3.硬质材料处理法（尿素法）（Grant等，1998）

对于根或根状茎等较硬的材料，在抽提液中加高浓度的尿素，在操作步骤中使用两步沉淀法使多糖和次生产物分步沉淀，而DNA留在上清液中，保证了DNA提取的数量和质量，效果很好。

主要步骤包括：

①洁净的干材料用刀削成小块，在研钵中加液氮研碎；②将材料粉末转移至离心管中，加抽提缓冲液，缓慢翻转混匀；③加SDS粉末至终浓度为1%（w/v），室温放置，不时混合；④添加PVP溶液至终浓度为6%，再加1/2体积的醋酸铵溶液，冰浴中放置；⑤离心2次；⑥上清液加等倍量的异丙醇混合，室温放置，离心；⑦沉淀用乙醇清洗，晾至无醇味，用TE缓冲液溶解。

4.大数量样本的快速提取方法

目前中药分子鉴定用的主要是与PCR技术有关的DNA标记，即提取得到的DNA首先进行PCR反应，如果样本数量很多，快速的DNA提取方法显得很必要。目前文献记录的快速提取方法都是使用特殊的细胞裂解（提取）液，直接取裂解上清液进行PCR反应，当然这种方法仅限于幼嫩的材料。

方案Ⅰ主要步骤包括：

①取生长幼苗，放入96孔联板中，加蒸馏水，每孔中加入一枚微型转子（8mm×3mm）；②将联板置于-80℃冰箱中迅速取出放在特制搅拌器架上，开启电源，使孔内转子旋转，材料被充分打碎；③每孔中加提取缓冲液，搅拌；④吸出混合物到第二块板的孔中，再加缓冲液中和。

方案Ⅱ主要步骤包括：

①从叶片上取叶片材料，放在平底96孔联板中；②在每个孔中放玻璃珠和提取缓冲液，用96孔平板盖盖好；③使用与Eppendorf管适配的热混合器，65℃保温，不时振摇；④离心片刻。

方案Ⅲ主要步骤包括：

①取叶片，剪碎成小块。②将叶片碎块放在PCR薄壁管中，加MicroLYSIS去污混合液，用无菌小棒混匀。③将管子放在PCR仪上，按下列程序循环2次：65℃，5min；96℃，2min；65℃，4min和96℃，1min；65℃，1min；96℃，30s，存于-20℃。取上清液即可进行PCR反应。

5.微量材料的提取方法

如果制备DNA的材料来之不易，直接在离心管内操作，不用液氮粉碎，可减少不必要的损失，在加有材料（干材料30～ 50mg，鲜材料100～ 200mg）的管中加少许石英砂，用特制加工的玻璃研锤（大小与离心管底适配，一端用金刚砂磨成毛面）研碎，之后依照上述一般提取步骤提取DNA。

6.试剂盒提取与纯化方法

使用专门用于DNA提取的试剂盒，可令制备DNA变得简单、方便，既节省时间又保证质量，其中专用于制备植物DNA的试剂盒有德国QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit（Cao等，1998；王艳等，2000），美国Amersham Pharmacia Biotech公司生产的Nucleon Phytopure系列等，后者可以有效地去除植物和真菌的多糖。对已提得的DNA溶液，若采用试剂盒纯化，可选用QIAGEN公司的QIAGEN Genomic tip 500/G，或QIAquick PCR Purification Kit。使用试剂盒纯化实验步骤，一般按照有关公司说明书进行。

二、实验材料的预处理方法

幼嫩的叶子和幼苗是DNA提取的最佳材料，因为植物代谢最旺盛时期的组织中核酸含量很高，其他杂质则含量少。由于缓慢死亡的组织中的DNA会被植物细胞自身释放的DNA酶所降解，而暴露在空气中的DNA也会被空气氧化而分解。新鲜的材料采好后迅速密封，尽快放在避光的冷环境中（如冰壶、冰袋），或立即放入-75℃超低温冰箱中保存。在不具备低温保持材料新鲜的情况下，如野外采样，可以用硅胶快速干燥方法，使用叶片10倍量的变色硅胶与叶片共同放入密封袋中，硅胶要保证干燥，如果发现硅胶已从深蓝色变为粉红色，要及时更换，回到实验室后要将干燥好的材料放在干燥器或超低温冰箱中（密封以防吸潮）。

1.洁净

目的是去除任何可能的外源DNA污染，如细菌、真菌等。幼嫩的叶子和幼苗一般比较干净。如果是根、茎、果类材料，用蒸馏水清洗后，要用刀认真刮取干净部分，花、叶、种子等或小饮片等小材料则尽可能切去菌斑、菌块，然后，用乙醇（浸泡1min，再用蒸馏水清洗3次，用干净的滤纸吸干水分，晾干）浸洗，或用紫外灯照射消毒，有些植物有与细菌或真菌共生现象，菌丝深入到组织内部，则外来DNA不可能去除干净。而有些材料，如冬虫夏草，本身就是多种生物的复合体，研究时应予以注意。

2.粉碎

材料经液氮速冻后粉碎是通用方法。对于新鲜材料，液氮处理可抑制DNase的活性，防止DNA的降解，但对干材料，液氮速冻可使材料变脆易磨，加玻璃砂或砂子共研则更经济，效果也很好，如果没有液氮，对于新鲜材料也可与砂子共研，只要同时加入提取缓冲液（可抑制DNase的活性）即可。对于根或木质茎等坚硬的材料，可以先用刀削成小块，再加液氮研碎。

3.特殊材料的处理

（1）孢子和花粉：

由于孢粉表面有一层含有孢粉素可以抗拒各种化学物质侵蚀的结构，从孢粉中提取DNA需要特殊的措施。具体方法如下：加孢粉粒到离心管中，加1微玻璃珠（直径为1mm），再酌量加提取缓冲液，液体刚好没过玻璃珠，在Mini-Beadbeater仪器上振动，37℃保温，再进行其后的抽提和DNA沉淀。

（2）种子：

种子一般含有较多的油脂，可以用脂溶性的溶剂先处理种子脱脂，再用脱脂后的粉末进行DNA提取。

（3）腊叶标本和植物药材：

使用上述的CTAB法和高盐低pH法都可以，由于DNA大多降解成小碎片，建议提取过程中加长沉降时间，具体方法如下：CTAB提取后，氯仿/异戊醇抽提时，离心；加异丙醇沉淀DNA时，4℃离心，-20℃放置，再4℃离心，弃去上清。

（4）动物药材：

关键是清洗和消毒，具体方法如下：取样品置Eppendorf管中，加浸泡液，56℃烤箱中浸泡；取出管子，置旋涡混合仪上振摇，弃浸泡液，加三蒸水振荡2次，弃水液；加75%乙醇，用消毒过的剪刀将样品剪成碎片置旋涡混合仪上振荡，离心，弃乙醇，加三蒸水振荡，弃水液。

（5）乙醇浸制植物标本：

浸制植物标本常用不同浓度的乙醇，95%的乙醇对材料中DNA的保存效果较好，在DNA提取过程中，初始抽提液中加一定量的蛋白酶E或K，因为乙醇浸制的情况下，蛋白质与DNA结合，必须用蛋白酶将蛋白质降解掉，从而把DNA释放出来。

（6）福尔马林浸制的动物标本：

处理的关键是去除残余的福尔马林，否则会抑制DNA提取过程中用于组织蛋白消解的蛋白酶的活性。具体方法如下：先去掉标本的表层，切成小块，用新鲜的GTE缓冲液在摇床上振荡清洗。

三、次生代谢产物的去除方法

1.多糖类物质的去除

如果材料中有含有较多的多糖类成分，其提取液常比较黏稠，多糖会与DNA共沉淀而使沉淀物呈胶冻状。少量的多糖一般不影响DNA的限制性酶解或PCR扩增，但如果多糖过多无法进行下一步研究时，则要考虑在提取DNA过程中去除多糖。

主要步骤包括：

①清洗：材料粉碎之后，先不加细胞膜裂解液，因为DNA尚未溶出，用一些含Sorbital、PEG缓冲液清洗，可除去一些多糖；②沉淀：在从提取液沉淀DNA之前，先加入0.35倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀；③多糖和DNA共沉淀物再分离：由于DNA的水溶解性大于多糖，用TE缓冲液反复清洗共沉淀物，将清洗液合并再用醇沉淀DNA；或将沉淀物溶解后，经过琼脂糖电泳，切下DNA部分，再将胶回收；④使用可降解多糖或可与多糖反应的物质：采用多种果胶酶如Caylase M3、Sigma P2401、Sigma P4716、Worthington LS004297等可以分解多糖为寡糖或单糖。使用时将多糖与DNA的共沉淀物用含果胶酶的缓冲液消解，需要注意的是果胶酶中一般含有微量的核酸酶，会减少DNA的量，故此缓冲液中一定要有足够量的EDTA，以抑制核酸酶的活性。还有在SDS提取缓冲液中加一定量的氯苯（v/v=5∶3），氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。

2.鞣质和多酚类物质的去除

含有酚类杂质的DNA沉淀物多呈黄色至褐色，难以溶解或使溶液颜色变深。由于酚类化合物在植物材料中存在十分普遍，因而提取缓冲液中要加入一定量的2-巯基乙醇以防止酚氧化；或加PVP，使与酚类结合。

主要步骤包括：

①酚类的预提取（清洗）：对未粉碎的干材料可水浸过夜，主要去除水溶性鞣质等；对粉碎后的材料用丙酮浸提，去除脂溶性酚类化合物或用可去除酚类的缓冲液；②加抗氧化剂：提取缓冲液中加一些防止酚类氧化的试剂，如Vc（抗坏血酸）（参考终浓度为30～ 60mM）、半胱氨酸（参考终浓度10～ 60mM）、亚硫酸钠（参考终浓度10mM）、DTT（二硫苏糖醇）（参考终浓度0.1%）、二乙基二硫氨基甲酸（参考终浓度4mM）及精胺（参考终浓度4mM）、亚精胺（参考终浓度1mM）等；③加酚结合剂：提取缓冲液中加入易与酚类结合的试剂。这类试剂与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合，PVP属于这一类，还有PEG（参考浓度10%）等。对于既含多糖又有多量酚类的材料，也可用上述提到的各种柱层析纯化。

上述去除多糖和酚类的方法常组合使用，但在针对具体研究对象时，仍需要选择和优化。