过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer，ACT）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内，该过程通常还包括非清髓性预处理和免疫刺激剂的应用，有的方案还包括在扩增前对淋巴细胞进行基因修饰，使其靶向特定抗原、表达内源性免疫刺激分子，或回输后持续存在更长时间。

需要注意的是，虽然ACT的治疗效果通常被归功于CD8 ⁺细胞，但有研究发现回输纯化的CD4 ⁺细胞在黑色素瘤患者中也可导致持久的临床缓解。相反，虽然临床前试验中自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）取得了令人鼓舞的疗效，其在临床试验中的效果却尚不理想。类似的，B细胞在肿瘤ACT中的作用也尚未充分得到证实，而且有研究报道存在具有免疫抑制作用的B细胞，称为调节性B细胞（B regulatory cell）。

临床上，对于恶性黑色素瘤和肾细胞癌，TIL是最常用的ACT治疗。TIL是浸润于肿瘤中的淋巴细胞，分离后在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）等因子作用下进行体外扩增，最后再回输到患者体内。该方法是20世纪80年代美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）的Rosenberg等研发的。近期进行的一系列临床试验中，有部分转移性黑色素瘤患者在接受了TIL治疗后，其肿瘤出现持久的完全消退，这显示了ACT在肿瘤治疗中的强大潜力。在这些试验中，转移性黑色素瘤患者，经非清髓性预处理后，使用自体TIL联合IL-2治疗，总有效率接近50%，甚至可以有20%至40%获得持久的肿瘤消退，而且其中大部分是常规治疗难治的病例。然而，临床上很多情况下是无法应用TIL的，比如有的患者缺乏肿瘤标本，还有的患者肿瘤或转移灶中淋巴细胞浸润很少。在这种情况下，ACT就要使用外周血淋巴细胞了。最早发展起来的使用外周血淋巴细胞的ACT包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine-activated killer cell，LAK cell）、抗CD3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-CD3 antibody-induced activated killer cells，CD3-AK cells）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinduced killer cells，CIK cells）等。

LAK也是在20世纪80年代由Rosenberg等研发的，其实质是IL-2激活的具有杀瘤活性的NK和T细胞。1984年11月Rosenberg研究组经美国食品和药品管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）批准，首次将LAK细胞用于临床治疗。该疗法对转移性肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌和非霍奇金淋巴瘤患者的疗效较显著。但LAK杀伤力不强，临床应用需要大量输注。而且其扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用IL-2，从而导致明显的毒副作用，最常见和最严重的毒副作用是毛细血管渗漏综合征（capillary leak syndrome，CLS），主要表现为全身性水肿和多器官功能失调，可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。

CD3-AK是1989年NCI的Yun YS等用CD3抗体活化小鼠脾细胞后得到的，并在体外观察到其细胞毒活性强于LAK。动物体内实验，同样验证了CD3-AK的抗瘤活性。CD3-AK对肿瘤患者的疗效也有研究，但总的来说，对CD3-AK的研究数量远远不如TIL、LAK、CIK等。

CIK细胞是继LAK细胞治疗后又一个在临床上广泛开展的细胞治疗方法。早在1986年Schmidt等就发现在正常人外周血单个核细胞中有2%-5%的细胞同时表达CD3和CD56两种抗原，且这种细胞对K562有天然杀伤作用。这就是CIK细胞的雏形，当时人们对这种细胞了解甚少。CIK细胞在未经处理的外周血单个核细胞中比例很少，因此人们通过体外刺激培养以扩增其数量。1991年美国斯坦福大学医学院骨髓移植研究中心报道了用IFN-γ、IL-2、抗CD3单克隆抗体和IL-1刺激外周血单个核细胞，诱导产生了CIK细胞。这种CIK细胞对淋巴瘤细胞有强大的杀伤作用而对正常的造血干细胞影响甚微。CIK细胞凭借其增殖速度快、杀瘤活性高、非主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制、对正常骨髓造血影响轻微等优势，成为肿瘤治疗中重要的辅助治疗方法。

TIL属于天然的具有肿瘤特异性的淋巴细胞，而CIK等则是非特异性的活化的淋巴细胞。研究者曾尝试通过自体和异基因抗原体外诱导外周血淋巴细胞以产生抗原特异性T细胞，但真正能用于肿瘤患者临床治疗的可行方案却寥寥无几，其原因在于体外诱导的效率太低，操作过程复杂，扩增时间长，且扩增数量有限，因此往往达不到预期治疗效果。若能直接赋予外周血淋巴细胞肿瘤特异性反应能力，则有望大大提高ACT的疗效。所幸，随着生物技术的迅猛发展尤其是基因工程技术的进步，基因修饰的方法能够将识别肿瘤抗原的T细胞受体（T cell receptor，TCR）或CAR基因导入淋巴细胞使之成为TCR基因修饰T淋巴细胞或CAR-T细胞，从而人工赋予这些淋巴细胞对肿瘤抗原的靶向识别能力。

TCR是T细胞表面能够识别和结合蛋白质抗原的特异性受体。TCR基因修饰T淋巴细胞技术出现较早，但TCR具有MHC限制性，而且许多肿瘤细胞还能够通过下调或突变其MHC分子以逃避免疫监视，从而使得TCR基因修饰的T淋巴细胞的临床应用具有一定的局限性。

CAR分子在结构和功能上与TCR/CD3复合物十分类似，是表达在细胞膜外的单链抗体（single-chain fragment of variable region，scFv）通过胞外铰链区和跨膜区与胞内的T细胞活化序列组成的融合蛋白。第一代CAR-T细胞只具有单一的活化信号（常用CD3分子ζ链），体内存留时间短，很快出现失能。为此，第二代CAR在胞内部分增加了共刺激分子（最常用的是CD28）信号结构域，在提供活化信号的同时也提供了共刺激信号。第三代CAR的主要标志为胞内区采用了不止一个共刺激分子信号结构域。CAR对肿瘤细胞的识别是通过scFv介导的，不受MHC限制，其靶标分子可以不限于蛋白/多肽抗原。而共刺激分子信号结构域的引入则有效地克服了肿瘤通过下调共刺激分子造成的免疫逃逸，进一步增强了CAR-T细胞的活化能力和在病人体内持续存在的时间。

TCR基因修饰T淋巴细胞技术或CAR-T细胞技术使得研究者能够获得大量抗原特异性的T淋巴细胞，从而克服了黑色素瘤等少数肿瘤之外的其他类型肿瘤难以获取具有抗肿瘤活性的淋巴细胞的问题，大大推动了以免疫细胞为基础的肿瘤靶向治疗的发展，打开了癌症ACT新领域的大门。

手术、化学或放射治疗主要是通过外因的作用而达到治疗目的，而免疫疗法则体现了充分调动内因去实现治疗的思想。医疗实践已证明任何一种单一的治疗模式均不能圆满地解决肿瘤这一难题。因此，目前而言治疗肿瘤最理想的模式应是综合治疗。这并非把单一模式简单地相加，而是要根据不同肿瘤的特征和同一肿瘤所处的不同时期将各种治疗模式进行合理的组合。常规疗法可迅速清除大量的肿瘤细胞，降低体内肿瘤细胞负荷；而免疫疗法能持久清除残留在体内的少量的、播散的肿瘤细胞，且能提高机体因放、化疗而受损的免疫功能。故二者序贯性联合治疗，可提高肿瘤治疗效果，有可能达到治愈恶性肿瘤的目的。作为肿瘤免疫治疗主要组成部分的细胞免疫治疗也正逐步走向成熟。

肿瘤细胞免疫治疗作为肿瘤综合治疗的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗和其他生物治疗广泛联合，在多种肿瘤治疗中展示了其良好的应用前景。通过有计划合理地联合细胞免疫治疗和其他治疗手段，可望提高治疗效果，延长生存时间，改善肿瘤患者的生活状态，提高生活质量，最终达到长期带瘤生存或彻底治愈肿瘤的目标。

TCR基因修饰T淋巴细胞和CAR-T细胞在临床试验中都取得了一定的成功，但大多数的此类临床试验中都观察到了不同程度的毒副作用，甚至包括一些致命的并发症。这些与基因修饰T细胞ACT治疗相关的副作用主要分为两大类，即正常组织毒性（on-target toxicity）和脱靶毒性（off-target toxicity）。前者指的是基因修饰T细胞对同样表达其靶点的正常组织的毒性，这种毒性很常见；后者则指对不表达这些靶分子的正常组织或器官的毒性，其发生有一定的几率，预防有一定困难。

基因修饰T细胞对正常组织的毒性一直妨碍着这些研究真正从实验室走向临床。如何鉴定出肿瘤细胞上合适的免疫原性的靶点，从而使得基因修饰T细胞只攻击肿瘤细胞而不损伤正常组织，是肿瘤ACT治疗成功与否的关键。

在肿瘤ACT治疗的实践中常见的抗原根据其来源、表达部位以及突变与否可以分为七类。

靶向肿瘤组织过表达而正常组织表达量很低的分化抗原曾经是肿瘤免疫治疗研究的热点。TIL治疗在转移性黑色素瘤患者中所取得的成功最初也被归功于这些TIL细胞所普遍表达的识别黑色素瘤/黑色素细胞分化抗原（如MART-1和gp-100）的TCR，但现在看来似乎没有这么简单。有研究者使用特异性靶向MART-1或gp-100的高亲和力TCR基因修饰的T细胞治疗转移性黑色素瘤，意外地观察到了对眼、耳等正常表达黑色素组织的严重毒性反应，包括前房浸润、虹膜扩张、听力下降等。而在TIL治疗有效的转移性黑色素瘤患者中却极少观察到这种毒性，这提示TIL其实是通过靶向其他的抗原发挥抗肿瘤活性的。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是胃肠道肿瘤过表达的另一个分化抗原，在靶向CEA的ACT治疗中也发生了类似的情况，有研究者报道，靶向CEA的高亲和力TCR可以导致严重的结肠炎。这些毒性在很大程度上妨碍了靶向分化抗原的ACT治疗的临床应用。

此外，还有若干使用CAR-T靶向此类分化抗原的研究正在进行中。前面提到过，第二、三代CAR-T具有更强的活化能力和在患者体内更长的持续时间，但也正因为如此，CAR-T的靶点选择必须更加谨慎，否则其对正常组织的毒性会更严重。例如，曾有研究者使用携带CD28和4-1BB共刺激结构域的靶向人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）的CAR-T细胞治疗了一位结肠癌肝肺转移的患者。该患者在接受CAR-T细胞输注后15分钟出现呼吸窘迫和严重的肺浸润，最终出现心脏骤停而死亡。研究者认为，这一毒性反应的根源在于肺上皮细胞低水平表达Her-2，结果导致大量CAR-T细胞浸润至肺部并引发了CAR-T常见的副作用：细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），又称细胞因子风暴（cytokine storm）。

靶向过表达于肿瘤组织的分化抗原的尝试受困于对正常组织的毒性，那么能不能靶向仅表达于肿瘤和非关键的正常组织的抗原呢？毕竟如果能够清除恶性肿瘤的话，付出某些非关键的正常组织受损的代价也是可以承受的。这方面一个相当成功的例子就是通过靶向CD19这一表达于正常B细胞的抗原来治疗白血病和淋巴瘤。2010年，研究者首次报告靶向CD19的ACT治疗晚期白血病和淋巴瘤获得成功，虽然在此过程中正常B细胞也同样被清除，但通过使用免疫球蛋白可以很大程度上克服这一毒性。2014年10月16日的《新英格兰医学杂志》报道CD19-CAR-T治疗30例复发、难治的急性淋巴细胞白血病患者，完全缓解率达到90%，缓解时间最长者达24个月。这一结果是十分令人鼓舞的，当前，已有多个靶向CD19的CAR-T疗法正在进行临床试验，诺华公司和Juno公司的CD19-CAR-T已分别于2014年7月和11月获得美国FDA突破性疗法认定。可惜的是，除CD19外，此类抗原尚未见其他成功的例子。

癌-睾丸抗原（cancer-testes antigens，CTA）是此类抗原的代表，这类蛋白在胚胎时期表达，而在成年后的正常组织中通常处于表观沉默状态，但在约10%～80%的常见上皮性肿瘤中重新表达。这些肿瘤包括膀胱癌、肺癌、肝癌等。此类抗原中比较突出的一个是NYESO-1，现认为它仅表达于肿瘤。通过NY-ESO-1高亲和力TCR基因修饰的自体淋巴细胞治疗，研究者成功地使转移性滑膜肉瘤和转移性黑色素瘤患者体内的肿瘤大幅消退。应用这一方案治疗其他NYESO-1阳性实体瘤的研究正在进行中。必须要引起研究者足够重视的是，总数超过100种的CTA中，大部分在正常组织上有低水平的表达，而这同样可能成为严重毒性反应的源泉。此外，脱靶效应亦不得不防，比如，虽然人黑色素瘤相关抗原-3（melanoma antigen family A，3，MAGE-A3）不表达于正常组织，但靶向MAGE-A3的一个HLA-A2限制性表位的ACT治疗却意外地导致了严重的神经系统毒性。研究者最终发现这是因为该MAGE-A3表位与表达于脑的MAGE-A12的一个表位非常相似。

此类抗原指的是不表达于正常组织而又为某一类型肿瘤所共有的突变，这些突变是基因修饰淋巴细胞靶抗原的理想来源。表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor vⅢ，EGFRvⅢ）是这类靶点的代表。EGFRvⅢ表达于约40%的高分级胶质瘤细胞表面。该突变来自于EGFR第2至第7外显子的框内缺失（in-frame deletion），并导致EGFR组成性活化，可以在没有配体结合的情况下激活酪氨酸激酶，启动下游信号传导，进而使含有此突变的细胞的增殖、侵袭以及运动能力增强，最终导致肿瘤的发生。EGFRvⅢ-CAR在小鼠脑胶质瘤模型中已经取得了成功，用于人的EGFRvⅢ-CAR正在研发中。

参与肿瘤发生的病毒经常会导致外源病毒蛋白在肿瘤细胞上的表达，而正常组织则通常无此蛋白表达，因此，这些病毒编码的抗原也是理想的ACT靶点。此类备选的靶点包括人乳头瘤病毒（papillomavirus，HPV）E6、E7蛋白以及EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）和LMP2等。这些抗原均不在正常组织表达。筛选此类抗原时有一点需要注意，作为ACT治疗的靶点，该蛋白应是被感染的细胞恶性转化所必须的关键分子。例如，现已上市的HPV预防性疫苗是根据HPV的衣壳蛋白L1设计的，而在宫颈癌进展过程中L1可能丢失，并不适于作为ACT治疗靶点。研究显示，HPV感染细胞产生的E6、E7等蛋白通过影响细胞内的p53、Rb等信号通路导致癌变，而且E6、E7蛋白在宫颈癌及癌前病变中持续表达，与癌变密切相关，很少发生抗原丢失及免疫逃逸。因此，对HPV所致宫颈癌和癌前病变的ACT治疗，选择E6、E7作为靶点比L1更为适当。

肿瘤细胞仅是瘤体的一部分，肿瘤间质的某些关键成分也可能成为理想的肿瘤免疫治疗靶点。血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）在肿瘤血管过表达，成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）在肿瘤间质活化成纤维细胞过表达，它们都可能成为ACT治疗的靶点。但需注意的是，这两个分子在正常组织也有低水平表达，以它们为靶点的治疗可能导致一定的毒性。

基因突变是恶性肿瘤中的一个普遍现象，同时基因突变本身也是细胞恶性转化的动因之一，未来肿瘤免疫治疗的进展很可能来自于免疫靶向这些突变蛋白。黑色素瘤含有非常多的突变，这可能源于紫外线对皮肤的致突变作用。本文开头就提到，部分转移性黑色素瘤患者在接受了TIL治疗后，出现持久的肿瘤完全消退。但也由此提出了一个问题，这些TIL细胞的抗原靶点到底是什么？毕竟，并非所有的接受上述治疗的患者都达到了长期缓解。对此一个可能的解释为：黑色素瘤含有的突变包括两类，一类是驱动性的，另一类是随机的。靶向突变基因产物的TIL大部分识别的是随机突变的产物，而对于肿瘤来说这些随机突变的产物并非是维持致瘤性所必需的。因此肿瘤细胞可以通过突变、下调、甚至基因缺失来逃避这些TIL的杀伤。相反，一旦TIL靶向肿瘤细胞某些不可丢弃的突变基因产物，亦即与致瘤性密切相关的驱动性突变的产物，就可能获得更好的疗效，甚至达到长期缓解。前面提到的EGFRvⅢ本质上就是一种驱动性突变的产物。这一科学假设现已得到证实，近期，Rosenberg的研究团队对经TIL治疗后获得长期缓解的恶性黑色素瘤患者的肿瘤进行了全外显子组测序和生物信息学分析，成功发现了这些患者体内TIL细胞的新的突变靶点。其结果表明，黑色素瘤TIL细胞造成持久的肿瘤完全消退的独特能力正是来自于其对个体肿瘤的独特突变的特异性识别。尤其值得注意的是，这些研究者最新发表的一份报告揭示，这些新发现的TIL靶点都来自于与细胞增殖相关的重要基因的突变。

TIL在靶向黑色素瘤独特突变中取得的成功提示我们，识别其他肿瘤的独特突变的TIL或者基因修饰淋巴细胞很可能同样成为有效的治疗手段。然而，大部分其他类型实体瘤的突变数量仅有黑色素瘤的五分之一乃至十分之一，如何成功靶向这些突变可能会成为一个棘手的问题。在大部分肿瘤中，与驱动性的或随机的突变起反应的T细胞很可能十分稀少，但鉴定个体肿瘤的独特外显子突变并获得靶向这些突变的T细胞的方法正在积极研发中。

在不久的将来，我们将有望使用适当的基因筛选方法来分析每个肿瘤，找到对该肿瘤致癌性至关重要的基因突变，进而分离纯化出靶向该突变基因产物的T淋巴细胞，在体外对其加以培养扩增用于ACT治疗。甚至更进一步，分离纯化出这些T细胞后，我们还可以获取其TCR编码基因，以逆转录病毒、慢病毒等为载体，用该TCR基因修饰患者外周血T淋巴细胞，获得大量特异性靶向驱动突变基因产物的淋巴细胞，显著增强ACT的疗效。