第一节　细胞遗传学诊断技术

染色体病包括染色体数目异常和结构畸变。目前已发现的人类染色体病约10 000多种，已确定的综合征约100多种（详见“第四章染色体病”）。确诊染色体病的主要方法是染色体检查（详见“第三章遗传病诊断与遗传咨询”），包括经典的显带核型分析技术，以及分子细胞遗传学分析技术如荧光原位杂交（FISH）、微阵列芯片杂交技术（aCGH、SNP array）等。

一、显带核型分析技术

在细胞分裂的中期，松散的染色质丝通过多级螺旋化，形成在光镜下可辨认的染色体。因此，特定处理处于旺盛有丝分裂的组织细胞（如外周血淋巴母细胞、骨髓、绒毛、胸水、腹水、肿瘤组织、皮肤、肝脏、肾脏等），可获得染色体标本，从而在光镜下进行核型（karyotype）分析。

（一）G显带

G显带（G-banding）是将染色体标本用热、碱、胰酶、尿素、去垢剂或某些盐溶液预先处理，再用Giemsa染液（Giemsa staining solution）染色，所显示的带纹称为G带（G-band）。

G显带是最常用的核型分析方法。其基本操作流程如下：

静脉采血→加植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）进行淋巴细胞培养，37℃72小时→秋水仙素处理，使细胞分裂终止在中期→用KCl溶液进行低渗处理（hypotonic treatment），使细胞胀大，染色体分散排列→固定液处理、离心→细胞悬液滴片→胰酶处理，使G带区的疏水蛋白被除去或使其构型变为更疏水的状态→Giemsa染液染色→镜检和报告。

最后打印将一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来的图像（即核型），即为检测报告。

图2-1为G带核型照片。

G带核型的染色体深浅交替的带纹相当于DNA复制子簇（即2～100个复制子的集成），G带一般代表了晚复制的奢侈基因（luxury gene，即组织特异性基因，tissue-specific gene）。

（二）Q显带

用易于结合富含AT碱基的DNA序列的荧光染料（如喹吖因，quinacrine）处理染色体标本，在荧光显微镜下每条染色体出现宽窄和亮度不同的带纹，且不同染色体有其独特的带型，由此可以清楚地鉴别人的每一条染色体。这种用荧光染料所显示的带纹称为Q带（Q-band）（图2-2）。

Q带与G带的带纹非常相似，亮带相当于G带的深带，暗带相当于G带的浅带。但是，G带的观察不需要在昂贵的荧光显微镜下进行。

（三）C显带

C显带（C-banding）专门显示着丝粒及第1、9、16号与Y染色体长臂的异染色质（heterochromatin）区的带型。C带浓染的区域（C带区）为结构异染色质区域，即DNA高度重复序列区域。在人类染色体中，这些区域位于着丝粒区和Y染色体的长臂上。因此，C显带可用于多态性的分析。

C显带的基本原理是从染色体臂选择性地抽取DNA，而C带区DNA对抽取有较大抗性，从而保留了一部分DNA，因而可以使用染料显示出DNA的不同分布。

C显带的基本操作流程如下：

HCl（盐酸）处理，使DNA脱嘌呤→NaOH或Ba（OH）2碱处理，产生高水平的DNA变性，促进继发的DNA熔解→2×SSC液温育，使DNA骨架断裂并使片段熔解→Giemsa染液染色→镜检和报告。

C显带可见着丝粒区域深染，染色体臂呈较淡的轮廓（图2-3）。

C带不能对每个染色体加以鉴别，但其特点是专门显示着丝粒区异染色质部位、次缢痕以及Y染色体长臂远端部分。因此，可用来鉴别第1、9、16和Y染色体。如观察到的染色体均呈白色，则可能是碱处理过度的原因。

（四）N显带

N显带（N-banding）专门显示核仁组织区（nucleolar organizing region，NOR）的带型。用硝酸银染色，可使染色体的随体及核仁组织区呈现出特异性的黑色银染物，这种银染色阳性的NOR称为 Ag-NOR（图 2-4）。

Ag-NOR的可染性取决于它的功能活性，即具转录活性的NOR着色，但受染物质不是次缢痕本身，而是附近与rDNA转录有关的一种酸性蛋白。

（五）迟复制X染色体检测技术

一般认为，性染色质（X小体，X body）是一种晚复制的X染色体，可以用于临床确诊X染色体异常疾病中X染色体的变化特点。

中期染色体的两条姐妹染色单体各由一条DNA链所组成，而DNA是由4种单核苷酸以不同的排列组合形成联结而成的两条互补的多核苷酸链组成的一种双螺旋结构。当细胞在加有5′-溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）的培养液中进行分裂时，BrdU能取代胸腺嘧啶核苷酸（T）掺入到新复制的DNA核苷酸链中。因此，终止细胞培养前10小时加入BrdU后，由于组成迟复制的那条X染色体的两条染色单体的DNA链的一条核苷酸链的T大部分被BrdU取代，从而使得中期染色体出现螺旋化降低的倾向，影响与Giemsa染液的亲和力，因而着色浅。这样，根据这条X染色体与其他染色体所呈现的鲜明不同的颜色，就可以鉴定它为迟复制的X染色体（图2-5）。

二、分子细胞遗传学分析技术

传统的显带技术能够准确地诊断染色体数目异常，但往往不能检出低于5Mb的染色体结构畸变。因此，利用克隆的DNA探针检测染色体的分子细胞遗传学（molecular cytogenetics）分析技术应运而生，大大提高了染色体病检测的分辨率和准确性。

（一）荧光原位杂交

把某条染色体或其某个区带的特异DNA用带有荧光染料的地高辛配基、生物素等标记为探针，与染色体或间期细胞进行杂交，继而在荧光显微镜下观察杂交后的颜色信号，以此来检测染色体的方法，称为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）。FISH可鉴别难以确定的染色体重排（结构异常）或迅速（1～3天）诊断染色体数目的异常。FISH技术具有敏感度高、信号强、背景低、快速、多色等独特的优势，已成为临床细胞遗传学检测的常规手段，也是基因定位的有力工具。

1.常规分裂期FISH

主要分析常规显带法不能识别的微小标记染色体。例如，与某一整条染色体特异性杂交的染色体涂染探针，可快速准确地识别任何区域来源的异常染色体片段和染色体易位；由串联重复序列组成的双着丝粒DNA探针，常用于辨认含有微小着丝粒的染色体。

2.间期FISH

获得大量的中期染色体需经细胞培养及相应处理，而且大部分人体细胞（如绒毛组织、神经细胞、精子等）并不进行分裂，很难获取中期染色体分裂象，故间期FISH不仅避免了细胞培养的繁琐和耗时步骤，使得异常遗传物质的检测更为方便快速，而且可直接在组织切片上进行检测，已大量应用于羊水、绒毛等产前诊断和肿瘤细胞的染色体异常检测，以及精子非整倍体的检查等间期细胞遗传学研究（图2-6）。

3.多色FISH

采用2种或以上的不同荧光素标记DNA探针，与靶细胞中期染色体或间期细胞核杂交后，用相应的免疫荧光检测系统进行杂交信号的检测和放大，通过2种或多种不同激光片组合或特制的滤光片观察，杂交信号呈现出不同的颜色，这种方法称为多色FISH（multicolor FISH）。颜色取决于标记物连接的荧光物质和复染染料的不同。例如，连接物有AMCA（蓝色）、FITC（绿色）、rhodamine（红色），复染的荧光染料有 PI（红色）、DAPI（蓝色）、quinacrine（绿色）等。多色FISH适用于检测靶序列扩增水平、染色体微缺失、染色体易位携带者、不同染色体区域的结构异常、同时存在的几种染色体数目异常等。

（二）微阵列芯片杂交技术

用传统的染色体核型分析方法（如染色体区带染色分析、FISH等）可探讨许多染色体结构变异，但实验操作繁琐、分辨率低，特别是不能覆盖全基因组，故难以提供染色体变异位点的精确定位。因此，FISH通常用于辅助染色体显带分析。基于DNA芯片的比较基因组杂交技术（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）、单核苷酸微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array）的出现，解决了上述难题。

aCGH和SNP array的原理是：将待测DNA和正常对照DNA分别用红色和绿色荧光染料标记，混合，然后与全基因组DNA芯片或SNP芯片进行杂交。杂交后的芯片经激光扫描，所得的数据再用计算机进行分析，根据“log2比值”检测出缺失（红色过多）或重复（绿色过多）。

1.aCGH

aCGH通过微阵列准确地检出与疾病有关的染色体异常，大大加速了人类了解基因组DNA结构变异在遗传病中的意义。与传统的细胞遗传学方法相比，aCGH具有无与伦比的高分辨率和高灵敏度，能够在全基因组水平上精确检测染色体拷贝数的变化。

aCGH的技术流程包括（图2-7）：

步骤1～3：用荧光染料分别标记实验组和对照组基因组DNA。

步骤4：样本混合后与aCGH芯片杂交，冲洗。

步骤5～6：芯片扫描、数据提取和计算机分析。

2.SNP array

人类基因组DNA序列的31亿个核苷酸的0.1%～0.2%在不同人种、人群和个体之间存在差异，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。 SNP是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，为人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。在人类基因组中，平均约每500～1000个碱基对中就有1个SNP，估计SNP总数可达300万个甚至更多。许多SNP可引起不同的遗传性状，即遗传多态性，如红细胞的ABO血型位点标记、白细胞的HLA位点标记和个体药物代谢差异等。了解这些DNA序列的差异以及这些差异所代表的意义，将给疾病的预测、诊断、预后和预防带来革命性的变化。

目前，商业化的SNP array涵盖超过1 800 000个遗传变异标志物，包括超过906 600个SNP和超过946 000个用于检测拷贝数变异（copy number variation，CNV）的探针。 SNP array的技术流程如下：

被测样本DNA的抽提→DNA的质检→SNP array检测，包括扩增、标记、杂交和洗脱→用相关激光共聚焦扫描仪对杂交后的芯片进行扫描→数据处理，确定检出的SNP位点相应的核苷酸（包括SNP位点过滤、频率统计、关联分析、单倍型分析）。

aCGH和SNP array技术综合了染色体显带分析和FISH的优势，既覆盖了全基因组，又具有极高的诊断率和准确性，就像是一次高通量进行了成千上万次的FISH检测；另外，aCGH和SNP array技术的取材是基因组DNA，因而不需要细胞培养，可用于任何组织和细胞的检测。aCGH和SNP array已在诊断儿童孤独症、智障、先天性缺陷等染色体相关的微缺失和微重复综合征，以及产前DNA诊断、流产胎儿组织、白血病和肿瘤组织的DNA检测中发挥了重要作用，但尚不能用于检出染色体平衡易位、平衡倒位等平衡重排。