答：可溶性抗原如蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等与相应抗体发生特异性结合后，在适当的电解质参与下能形成肉眼可见的沉淀物，该现象即为沉淀反应。沉淀反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原抗体发生特异性结合阶段，此阶段反应快，一般只需几秒到几十秒即可完成，产生可溶性小抗原抗体复合物，为肉眼不可见反应；第二阶段为形成可见的免疫复合物阶段，其反应慢，常需数分钟到数小时才能完成，形成肉眼可见的免疫复合物，如沉淀线、沉淀环。根据使用介质的不同，沉淀反应可分为在液体中进行反应的液相内免疫沉淀试验和在凝胶中反应的固相内免疫沉淀试验两大类。液相内免疫沉淀试验可分为环状免疫沉淀试验、絮状免疫沉淀试验和免疫浊度试验；免疫浊度试验根据其原理又可分为透射免疫比浊试验、散射免疫比浊试验，而散射免疫比浊试验可根据抗原抗体反应的时间和反应结合的动力学分为终点散射免疫比浊试验和速率散射免疫比浊试验。固相内免疫沉淀试验最为常用的试验介质为琼脂糖，根据其实验方法不同可分为单向免疫扩散试验、双向免疫扩散试验及免疫电泳技术等。

答：单向免疫扩散试验是抗原在含有抗体的琼脂凝胶中扩散的一种定量测定抗原含量的沉淀试验。试验通常用浓度为0.3%～1.5%的琼脂糖凝胶，其孔径大于可溶性抗原和抗体分子的颗粒，因此可溶性抗原及抗体在凝胶内扩散犹如在液体中自由运动。在单向免疫扩散试验中，将定量抗体混匀在琼脂凝胶中，继而加抗原溶液使其单独在凝胶中扩散，抗原在扩散过程中自然形成浓度梯度，在抗原抗体比例合适的部位，两者结合形成沉淀环，沉淀环的大小与加入的抗原量成正比。随着琼脂糖厚度的增加，沉淀环面积会相应缩小。其次，琼脂糖孔容积与加样体积对试验结果也有影响。体积不同但抗原绝对量相同的样品，加样体积越小，沉淀环面积相应加大，其原因可能在于抗体板上层空间未被抗原完全利用，只在下层向四周扩散，故形成的沉淀环面积稍大。因此，只有抗原液加满小孔，沉淀环面积才较符合真实数值。另外，琼脂糖凝胶板孔间距离对结果也会造成影响。为了减少沉淀环间的相互干扰，两孔间距离应比两个沉淀环最终扩散半径之和再加大5mm。

答：对流免疫电泳是将双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速免疫扩散技术。试验时在琼脂板上打两排孔，左边的阴极侧各孔加入待测抗原，右边的阳极侧各孔内加入相应的抗体。由于在pH 8.4以上的缓冲液中，大部分蛋白质抗原成分带负电荷，在电场中向正极移动；而作为抗体分子质量大，暴露的极性基团较少，解离也少，在电场中虽然也向正极缓慢移动，但电渗引向负极移动的液流速度超过了其向正极移动的速度，导致抗体移向负极，因此通电后，带负电荷的抗原向阳极抗体侧泳动，而抗体借电渗作用向阴极抗原侧移动，在两者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线。若抗原浓度超过抗体，沉淀线靠近抗体孔，抗原浓度越高，在抗体孔边缘出现弧形沉淀线，甚至超越抗体孔。由于对流免疫电泳结合了电泳技术，在电场中双向免疫扩散的速度大大提高，因此其灵敏度比双向免疫扩散法高很多倍，测出的蛋白质浓度可达μg/m l。

答：对流免疫电泳是指在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗体在琼脂凝胶中由于电泳和电渗作用，致使抗原向正极移动，抗体向负极移动，两者在两孔之间相遇，并在比例合适时形成沉淀线。电泳迁移率是在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。而电渗是电场中液体对固体的相对移动。在电泳时由于载体不能移动，通电后水分子向负极移动，形成电渗。电渗的大小与水分子移动的速度密切相关，而水分子的移动速度又与载体的性质、缓冲液的离子强度、电泳时的电压密切相关。电渗作用不影响蛋白质分子的分离，各蛋白质成分之间的相对迁移率不变，但蛋白质原点的位置向负极偏移。因此，当电渗的速度大于蛋白质分子电泳的速度时，某些蛋白质分子虽然带有负电荷也向负极移动。

答：火箭免疫电泳技术是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项检验技术。在电泳时，当待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动，当抗原抗体达到适当比例时，形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动。未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀，继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原含量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰。实验中抗体浓度保持不变，沉淀峰的高度与抗原量呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度的标准抗原泳动后形成沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。待测样品浓度即可根据沉淀峰长度在标准曲线中计算获得。在一定范围内，沉淀峰的高低与抗原浓度成正比。如果在琼脂中加入固定浓度的抗原时，便可检测待测抗体的含量，即反向火箭电泳。由于电场作用加速了抗原（抗体）的扩散速度，因此火箭免疫电泳实际上是加速度的单向免疫扩散。

答：火箭免疫电泳虽较单向免疫扩散技术更为快速、方便，但在应用时也受众多因素影响。首先，火箭免疫电泳只适用于pH 8.6以上环境中带有负电荷的蛋白质抗原。IgG、IgA等在pH 8.6条件以下净电荷几乎为零，若要使其在电场中也向正极移动，可用经甲醛与蛋白质分子中的氨基结合即甲酰化处理来增加其净负电荷量，抑制碱性基团的解离，使本来带两性电荷的蛋白质分子变为只带负电荷，加快电泳速度，抵消电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。另外，火箭免疫电泳所用的琼脂需选择无电渗或电渗小的，不然易使火箭形成的形状不规则，其次是注意电泳的终点时间，如果火箭电泳的顶部呈现不清晰的云雾状或圆形，皆提示未达终点，应继续电泳。当标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样，加样后马上电泳，否则易形成宽底峰形，使定量不准。在作IgG定量和测定补体蛋白时，血清分离后应立即使用，若不马上测定应置于-20℃冻存。此外，抗原和抗体的比例要适宜，抗原过浓不能得到圆锥状尖峰，而抗体太浓会使沉淀峰太低，从而影响实验的灵敏度。

答：免疫电泳（immunoelectrophoresis，IE）是将区带电泳与抗原抗体特异性反应（免疫双扩散）相结合的一种免疫技术，根据沉淀弧的位置、数量、形态，可分析样品中所含抗原成分及其性质。常用于血清蛋白组分的分析和抗原、抗体纯度及组分的检测。虽然免疫电泳既有抗原抗体反应的高度特异性，又有电泳分离技术的快速、灵敏和高分辨率，可以鉴定混合抗原中的各个组分，但免疫电泳技术也受很多因素的影响。对于异常结果的分析增加了复杂性，比如沉淀弧数目不总是与混合物中应有的成分相符，这种现象的产生原因可能是由于抗原抗体比例不合适，使得一些成分未生成沉淀线，或者由于相邻的两抗原的迁移率非常接近而致两条弧线重叠；也可能一条沉淀线分离成多条线。因此，用该方法检测多种混合物时，至少要用三种不同的浓度、两种或两种以上抗体（免疫不同动物而得）进行反复验证，而且要染色后及时观察并记录沉淀弧出现的情况。

答：免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的一项技术，具有很好的实用价值。应用免疫固定电泳进行检测分析时，待检样品先在琼脂凝胶板上作区带电泳，蛋白质分离成不同区带，然后再在各泳道上覆盖各种不同类型的抗血清（如抗IgG、IgA、IgM、κ及λ的抗血清），当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物在固相内沉淀。然后通过漂洗和染色，并与蛋白质参考泳道对照分析，便可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。因此，免疫固定电泳可用于鉴定迁移率近似的白蛋白、M蛋白、免疫球蛋白轻链和尿液中微量蛋白和脑脊液中寡克隆区带等。免疫固定电泳最大的优势是分辨率强、灵敏度高，操作周期短，仅需数小时，且结果非常直观易于分析。

答：免疫浊度测定是将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。当可溶性抗原与相应的抗体两者比例合适时，在特殊的缓冲液中可快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当抗原抗体的比例恰当时，两者结合完全，既无过剩的抗原，也无过剩的抗体，这时免疫复合物的形成和解离速度相等。当抗原过量时，形成的免疫复合物分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射也减少，这就是高剂量钩状效应。当反应液中抗体过量时，免疫复合物的形成随着抗原量递增至抗原、抗体最适比例时达到最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。为此，免疫浊度测定中抗原抗体的比例是影响浊度形成的关键因素。

答：免疫比浊法使用增浊剂的目的是提高反应速度。某些非离子型亲水剂对促进免疫复合物的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG）、 吐温 20， 其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进能特异性结合的抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。因此，在进行免疫比浊试验时通常在反应液中加入增浊剂。

答：免疫比浊法测定时要求抗体的特异性强、效价高、亲和力强，并使用R型抗体。抗体的特异性强是抗血清最核心的要求，即该抗体只针对某一种抗原，与其他无关抗原不发生交叉反应，特异性抗体和相应抗原结合后形成的浊度才能代表真实的实验结果。抗体的效价高是根据抗体的量而言，若使用低效价（<1∶20）抗体会增加非特异性浊度的产生。抗体的亲和力是指抗体与抗原结合的牢固程度。亲和力强则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的免疫复合物较牢固，不易发生解离，这在速率比浊法时尤为重要。根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型（rabbit type）抗体和 H（horse type）型抗体，R型抗体是指以家兔为代表的小动物注射抗原免疫后制备的抗血清，这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离，H型抗体是指以马为代表的大动物注射抗原后制备的抗血清，这一类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易再解离。因此，在进行免疫比浊分析时需综合考虑所用抗体的特性。

答：绘制标准曲线是以不同浓度的标准蛋白质含量为横轴、速率单位值为纵轴，于方格坐标纸上绘制曲线。根据待测样本的速率单位值，从标准曲线上查出相应的蛋白质含量，再乘以样本稀释倍数，即为待检样本中蛋白质的含量。由于标准曲线会随试验条件的变化而改变，因此需经常加以修正，并且在常规试验中进行室内质控以保证检测结果的正确性。质控样本的结果变化不能超出一个标准差。由速率散射浊度测定法的原理，反应系统中抗体的设置是过量的，只有在这种情况下随待检样本中抗原量的升高而出现高速率单位值。实际工作中如果个别样本中的抗原浓度过高，出现抗原过量（超过抗体量），反应杯中只能形成小的免疫复合物，从而出现低速率单位值。此时为判明结果的正误，可再加入稀释样本，如果速率单位值不升高或更低时，证明抗原过量；如果速率单位值升高则说明确实是样本中抗原含量是低的。随着先进的检验仪器不断问世，自动化程度越来越高，绘制标准曲线和鉴别抗原是否过量均可由仪器自行完成。

答：速率散射比浊法（rate immune scatter turbidimetry）是一种用于检测体液中蛋白质成分的微量、快速、可自动化的免疫化学检测技术，是将抗原抗体的沉淀反应与散射比浊光的强度相结合，在单位时间内对抗原与抗体结合的速度进行动力学测定，这种结合速度即速率。当抗体浓度固定于一定范围时，速率峰值的高低与抗原含量成正比。有数据提示，随反应时间的延长，免疫复合物的量逐渐增多，抗原抗体结合速率的峰值在25秒时出现，不同抗原含量其速率峰值不同。速率散射比浊法快速，检测时无需等到抗原抗体反应达到平衡，而是在起始阶段测定反应的速率，大大节约了实验时间，每小时可检测数十份标本，该试验较灵敏，其最小检出量可达ng水平。此外，该试验检测范围较广，理论上任何能形成抗原抗体沉淀反应的物质均可用此法测定。目前临床实验室采用的速率散射比浊法均为仪器和试剂配套系统，保证了实验的精确性，因此被推广应用于特定蛋白定量。

答：抗原抗体反应仅在两者分子比例合适时才出现最强的反应。以沉淀反应为例，在一系列含定量抗体的试管中依次在各管内加入递增量的相应可溶性抗原，根据形成的沉淀物以及抗原与抗体的比例关系，可绘制成曲线。曲线的峰段是抗原抗体分子合适比例的范围，即抗原抗体反应的等价带（zone of equalvalence）。在该段范围内，抗原抗体充分结合，沉淀物形成多而快速，其中一管反应最快，形成的沉淀物也最多，上清液中不再存在游离的抗原和抗体，因而反映了抗原抗体反应的最适比例，即最适比。在等价带前后，分别为抗体过剩带和抗原过剩带，此时沉淀物的形成均相应减少，甚至无沉淀物形成。如因抗体过量而无沉淀物形成，血清学试验中称之为前带现象（prezone）。反之，因抗原过量而无沉淀物形成则为后带现象（postzone）。此即著名的钩状效应。目前钩状效应多指抗原过剩，又称高剂量钩状效应，常导致假阳性结果的产生。现已有仪器增加了抗原过剩检测功能，可自动选择高比例的高浓度标本导致的假阳性。