答：荧光免疫测定（fluoroimmunoassay，FIA）是将荧光检测技术与抗原抗体反应相结合的标记免疫技术，具有高度灵敏度、特异性和直观性。荧光免疫技术是三大经典标记免疫技术中起步最早，是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。荧光免疫测定技术主要用于体液标本中抗原或抗体的定量检测，根据标记荧光物质和检测原理的不同，荧光免疫测定可分为时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）、荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）、荧光酶免疫分析（fluorescence enzyme immunoassay，FEIA）和流式荧光免疫分析（flow cytometry and fluoprescence immunoassay）等。

答：荧光是指某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。许多物质都可产生荧光现象，但是只有少部分才能作为免疫测定的标记物，因为其必须具备一些条件：①它本身具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合的复合物不易解离，而未结合的荧光物质及其降解，易于去除；②其与蛋白质结合后，仍能保持其荧光效率；③其色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④其与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化和免疫性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。将已知的抗原或抗体标记上有上述特点的荧光基团，利用荧光检测仪可检测到抗原抗体复合物上荧光信号，从而进行定性或定量测定。

答：荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪测定抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。其基本原理是在抗原抗体特异性结合的基础上，借助荧光检测技术的高灵敏度，实现对小分子或微量物质的测定分析。如荧光偏振免疫测定，采用竞争法使样本中小分子待测抗原与试剂中荧光素标记的相同抗原共同竞争结合特异性抗体分子，根据荧光素标记抗原与荧光素抗原抗体复合物之间荧光偏振强度的差异，测定体液中小分子抗原物质的含量。

答：一般来说，荧光物质是通过吸收外界能量（如光能、化学能）进入激发态，当其从激发态回至基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式发射出来，从而形成荧光。能产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素。常用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素（fluorescence isothiocyanate，FITC）、四乙基罗丹明（tetraethyl rhodamine， RB200）、 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC）、藻红蛋白（phycoerythrin）等。荧光分子在某些理化因素（如紫外线照射、高温、有机溶剂等）作用后，荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光形式发射。因此，在荧光免疫分析过程中，要注意荧光物质的避光保存。

答：荧光素标记抗体是由荧光素与特异性抗体通过共价键结合而成，是荧光免疫分析的关键试剂，其制备过程包括抗体的标记、纯化和鉴定。在制备荧光抗体时，需满足：①经荧光标记处理后抗体分子仍保留其特异性；②荧光素与抗体结合必须稳定；③标记抗体必须容易与未结合的荧光素分离；④微量标记物即可被检测出。为达到以上要求，用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力，目前通常采用单克隆抗体。如果使用抗血清，其中不应含有针对标本中正常组织的抗体成分，通常需经纯化提取后再做标记。对荧光素标记抗体的鉴定包括荧光素与蛋白质的结合比率、抗体效价和抗体特异性。其中，抗体效价的鉴定通常采用双向免疫扩散试验来测定，当抗原含量为1g/L时，抗体效价>1∶16较为理想。抗体特异性鉴定通过吸收试验和抑制试验检测，吸收试验是向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后，再用阳性标本染色，应不出现明显荧光；抑制试验是将阳性样本先与相应未标记抗体反应，洗涤后再用荧光抗体染色，荧光强度应受到明显抑制。

答：流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。其中，单克隆抗体上标记了不同的荧光素，可以对细胞的相关分子表达进行定量或定性检测。当前，临床流式细胞分析已成为检验医学发展的一个热点，从相对细胞计数到绝对细胞计数、从相对定量到绝对定量分析、从单色到多色荧光分析、从细胞膜成分到细胞内成分分析、液体中可溶性成分的流式细胞分析、分子表型分析均需荧光标记技术。

答：时间分辨荧光免疫测定是20世纪80年代初期发展建立的一种新型免疫分析技术。其原理和方法与一般免疫荧光法不同，所用示踪物不是荧光素而是具有特殊荧光特性的三价镧系稀土元素，如Eu ³⁺、Sm ³⁺、Tb ³⁺等为标记物标记抗体或抗原，检测标本中的相应抗原或抗体，反应完成后用时间分辨荧光分析仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度的变化定量分析反应体系中待测物的浓度。镧系元素荧光光谱的最大特征是激发光与荧光的波长差别显著，很容易利用简单的滤光片将激发光同发射光分开，同时消除激发光的散射引起的干扰。另外，生物样品的本底荧光波长通常为350～600nm，而镧系元素的发射光谱带较窄，多为603～623nm，利用610～620nm的滤光片可有效地排除来自生物样品的荧光干扰。

答：由于各类临床样本的多种组织、蛋白及一些化合物在激发光的照射下也能发出一定波长的自发荧光，这些非特异性荧光会干扰荧光免疫测定特异性。但这些自发荧光寿命短（一般不超过20ns），而镧系元素螯合物具有较长荧光寿命，为传统荧光的10 ³～10 ⁶倍。因此通过延缓测量时间，可以使寿命短的荧光猝灭，排除待测样本中非特异性本底荧光的干扰，只得到与目标物结合的镧系元素螯合物发出的特异性荧光，从而提高检测的特异性。与一般的荧光分光光度仪不同，时间分辨荧光分析仪采用脉冲光源，照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异性荧光本底衰退后，再测定样品发出的长寿命镧系荧光。

答：如采用镧系稀土元素铕（Eu ³⁺）标记抗原或抗体，免疫反应完成后，形成的Eu ³⁺标记抗原-抗体复合物在弱碱性溶液中经激发后的荧光信号相对较弱，加入酸性增强液可使Eu ³⁺标记抗原-抗体复合物的pH降低至2.0～3.0，Eu ³⁺从复合物上完全解离下来，游离的Eu ³⁺可被增强液中的螯合剂所螯合，在协同剂等其他成分的作用下，与增强液中的β-二酮体生成一个以Eu ³⁺为核心的保护性胶肽分子团，这是一个具有高强度荧光的稳定螯合物，信号的增强效果可达上百万倍。因此，时间分辨免疫荧光测定的方法特异性强、灵敏度高（下限可达10 ^-16mol/L）；分析范围宽（跨越4～5个数量级）；分析速度快，易于自动化；标记物结合稳定，有效使用期长；无放射性污染。其不足是易受环境、试剂盒和容器中的镧系元素离子的污染，使检测本底增高。

答：这是荧光酶免疫测定采用的荧光检测原理，以最常用的酶和荧光底物为例：采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）标记抗体（或抗原），以4-甲基伞酮磷酸盐（4-Methylumbelliferyl Phosphate，4-MUP）为ALP反应荧光底物，ALP分解4-MUP使其脱磷酸根后形成4-MU。4-MU经360nm激发光照射，发出450nm荧光，通过荧光检测仪测定荧光强度，并推算待测抗原或抗体的含量。荧光酶免疫测定将酶促反应的高效性、抗原抗体反应的特异性以及荧光效应的可检测性相结合，具有高度的特异性、灵敏性和直观性，广泛应用于病毒抗体、激素、肿瘤标志物、过敏原、心肌损伤标志物和凝血因子等的测定。

答：流式荧光免疫技术是建立在免疫微球、免疫荧光和流式细胞技术等基础上的一种新的血清学检测技术。其检测原理是以荧光微球为载体，通过在微球表面进行相应的免疫反应形成带有荧光的免疫复合物，然后利用流式细胞仪检测相应微球的数量和荧光表达，达到定性和定量检测小分子化合物的目的。其中，流式细胞仪可以实现对单个微球的检测，因此流式荧光免疫技术可以检测含量很低的生物活性化合物。与其他免疫测定方法相比，流式荧光免疫测定具有以下优点：①高通量，可同时对同一标本中的多种不同目的分子进行检测；②高灵敏度，最高的检测下限可达0.01pg/ml；③线性范围宽，检测浓度范围为pg至μg级；④反应快速、重复性好，杂交或免疫反应在悬浮的液相中进行，反应所需的时间短（20～40分钟），杂交后可直接读数，所以检测效率高于固相杂交；⑤操作简便，整个反应过程只涉及加样和孵育，最后上机读数。