在临床输血中，因Rh血型系统中D抗原的抗原性最强，《临床输血技术规范》只要求做D抗原鉴定。凡被检红细胞和抗-D试剂凝集者（≥2+）判定为Rh阳性（参考表6-1），无凝集者判定为初检Rh阴性。介于±~2+则为D疑难血型。

本节主要讨论临床输血科的观点，内容没有特别注明目的，仅以临床输血科的观点探讨RhD的问题。

盐水法只适用于室温条件下、盐水介质中、使用化学修饰的低蛋白或单克隆混合型IgM/IgG试剂血清、单克隆/多克隆低蛋白的Rh试剂血清检测Rh抗原，而不适用使用IgG型Rh试剂血清做Rh抗原鉴定。对于IgG型Rh试剂血清，要采用抗人球蛋白或微柱凝胶等实验技术进行检测。也可以分别用抗-C、抗-c、抗-E、抗-e试剂血清检测被检红细胞的C、c、E、e抗原。这时要采用C、c、E、e阳性红细胞悬液（配制方法同RhD阳性红细胞），做对应实验的阳性对照，判定标准同RhD。可参考本书附录四“RhD鉴定流程图”。

目前微柱凝胶血型卡及试管法的抗-D试剂特性及对于D、部分D、弱D的特性见表6-14。

抗-D血型试剂应为透明或带有特定颜色的液体，不得有浑浊或沉淀，可适当含有防腐剂。

临床常规应用的抗-D试剂，除应与DⅥ型等弱D抗原红细胞反应阴性的特定要求外，其他检测方法与鉴定人血清不规则抗-D抗体一样。

抗-D试剂效价不应过高，避免将弱D定为正常型，同时对抗体效价也有要求，避免将正常D抗原定为弱D抗原。建议合格试剂效价为64，抗体与红细胞混合后应在20秒出现凝集，在1分钟内出现凝集团块不小于1mm。

有效期不应少于半年，但不应多于2年，有效期内反应能力不应降低。

因为细菌污染后，抗体蛋白变性，其效价会降低，容易引起多凝集，造成血型定性错误。

不应含有任何增强剂，当患者红细胞在体内被IgG包被时，增强剂往往会导致假阳性反应。

由于RhD抗原的表达在人群中存在多态性，从很强的D到弱D，到最弱的D _el。抗-D抗体的选择对于检测红细胞表面D抗原非常重要，反应形式或反应的格局可能依赖于抗体的浓度、抗体的亲和力、抗体的克隆位点等，因此同种抗体的不同批号、不同的反应条件（温度、pH）也将造成不同的结果。目前商品化的鉴定试剂有单克隆混多株抗-D（IgM、IgG/IgM和IgG）3种，以输血为目的的常规检测应使用IgM单克隆抗-D试剂，而没有必要使用高效价的单克隆抗-D试剂及IgM/IgG单克隆抗-D试剂检测弱D、部分D及对D阴性的标本进行确认试验。

D变异型常被分成四种：弱D、部分D（包括类D）、D _el和非功能性的RhD。红细胞与抗-D试剂的凝集强度<2+可判定为RhD疑难血型。

（1）Rh血型鉴定。

（2）直接抗人球蛋白试验（DAT）及自身对照试验。

（3）弱D检测/IAT。

（4）吸收放散试验。

（5）分子生物学检查。

（1）目前多数商品做Rh血型鉴定试剂为化学修饰的低蛋白或单克隆混合型IgM/IgG Rh血型鉴定试剂，或单克隆/多克隆低蛋白血型鉴定试剂，可以采用盐水凝集试验。

（2）Rh抗原的检测必须严格遵照试剂说明书操作，如试剂和红细胞的比例及孵育温度和时间。有些试剂说明书需要阴性对照，则操作时应按照说明书设置阴性对照。但大部分说明书不需要阴性对照。

（3）如果直接抗人球蛋白试验阳性的标本使用单克隆混合型IgM/IgG Rh血型鉴定试剂检测Rh血型，可能发生抗原遮断现象，出现假阴性结果。

（4）如患儿RhD盐水凝集法检测为阴性或弱阳性时，或者与血清学不相符，必须结合病史、病情确定实验方案，应将患儿红细胞进行洗涤热放散试验将细胞处理，不必放散到直抗完全阴性。

（1）血型不合。急性血管内溶血或自身免疫性贫血患者，直接抗人球蛋白试验（DAT）阳性时可出现RhD假阳性。

（2）抗凝标本不当。检测过程中出现凝血或出现小的纤维蛋白凝块，误判为阳性。

（3）受检细胞与血清孵育的时间过长。

（4）血型鉴定试剂中含有事先未被检测的其他特异性抗体，造成假阳性结果。

（5）多凝集细胞可造成血型鉴定的假阳性。如多发性骨髓瘤患者，可能发生缗钱状凝集。

（6）检测用器材或抗体被污染，造成假阳性。

（1）DAT强阳性。例如患儿患有新生儿溶血病，红细胞被Rh抗体附着。

（2）RhD遮断现象。指RhD阴性的母体高效价的IgG抗-D进入RhD阳性胎儿血液循环，将胎儿红细胞上的D抗原位点全部封闭，出现遮蔽现象，以致常规方法检测RhD血型出现假阴性结果。

在临床上对有输血史、妊娠史的RhD阴性妇女，如再次生育的患儿出现高黄疸，虽然常规方法检测RhD为“阴性”，但患儿直接抗人球蛋白试验呈强阳性，同时又检测出ABO以外的抗体时，需考虑是否为Rh溶血。如患儿RhD盐水凝集法检测为阴性或弱阳性时，应将患儿红细胞进行洗涤热放散试验，将细胞处理至直接抗人球蛋白试验阴性或其他不损伤红细胞膜的方法将致敏在红细胞膜上的IgG抗-D放散后再做血型鉴定试验，此时红细胞上的D抗原会暴露出来，这时用抗-D试剂就能检测出来，对D抗原作出正确的血型鉴定；或过2~3天后重新抽患儿血样鉴定RhD血型。也有文献报道，经过木瓜酶/二硫苏糖醇（ZZAP）工作液处理，将包被的抗体处理掉，红细胞上的D抗原会暴露出来，这时用抗-D试剂就能检测出来，对D抗原作出正确的血型鉴定。

（3）红细胞与试剂比例失调。

（4）血型鉴定试剂漏加、错加和失效等。

（5）观察不仔细，离心后重悬细胞扣时，摇动用力过度，摇散微弱的凝集。

（6）弱D抗原或D变异型。

一般输血科常规不需做RhD弱D检测实验（weak D test，即D确认试验），但在献血者初筛Rh阴性及考虑要注射免疫球蛋白的孕产妇或新生儿时，则需进行弱D实验。

RhD抗原的表达分为正常D、增强D、弱D、极弱D（放散D、D _el）、部分D、D阴性6种。

由于D抗原是多个表位的嵌合体，其抗原数量减少或抗原结构产生变异而产生一些弱D和不完全D红细胞，它们虽然有Rh抗原，但与初筛使用的抗-D试剂血清可能无凝集或弱凝集而易造成漏检。这些红细胞上的D抗原的检测，需要用IgG抗D试剂血清做抗人球蛋白试验（弱D试验）。

极弱D（放散D、D _el）是一种非常弱的D抗原，只能通过吸收放散试验或基因检测技术确认或排除。

RhD抗原在不同类型的红细胞表达强度差异非常明显，即使在常见表型中RhD抗原的表达数量也存在着很大的差异。使用血清学方法进行检测，RhD阳性红细胞的凝集强度可表现为从很强的凝集到极弱的凝集再到不发生凝集。通常将凝集反应强度有别于常见RhD抗原阳性红细胞凝集强度的RhD抗原称为RhD变异型。

其D抗原量少，即抗原表位完整的正常D抗原数量少，可称之为弱D。需用间接抗人球蛋白试验方法来检测。

其与正常抗原相比有改变，使用血清学方法对部分D进行检测易造成漏检。

D抗原性弱的表型，用常规的血清学方法无法检出红细胞上的微弱D抗原，易误判为D抗原阴性，但能够用吸收放散试验检测出来。（D _el的输血可参考本书第一篇第四章第四节）

D抗原数量有很大程度增加，抗原也大大提高。

在人群中，大多数Rh血型是典型的RhD阳性，但由于受内外因素的影响，极少数人 RHD基因发生变异，血型血清学表现为弱D、部分D、极弱D以及RhD缺失型等。从本质上看，弱D、部分D、极弱D以及RhD缺失型等RhD变异都属于RhD阳性。应用分子生物学血型鉴定技术能够快速准确鉴定RhD血型及变异，但由于实验装备和材料等条件限制，基层实验室难以付诸实施，因此，血型血清学技术是更便捷可行的RhD变异型鉴定手段。采用血型血清学技术鉴定部分D和弱D等RhD变异型，首先需要选择适当的血型鉴定试剂和检测策略，以便有足够的准确度和灵敏度来确定最终血型。

RhD阴性的孕产妇怎么做产前筛查来预防RhD新生儿溶血病？

一般RhD新生儿溶血病都是发生在第二胎，所以若能在第一胎预先做好产前筛查，就可预防RhD的新生儿溶血病。

输血科常规的D抗原检测只做初筛，即使用IgM抗-D筛查D抗原。这个步骤对于输血前选择使用Rh阴性血的临床决策已经是符合实际需求的操作。但在产前筛查时初筛可能就不能符合实际需求。若产前能做孕妇的产前D抗原筛查，就可以执行有效的预防措施，一般对于RhD阴性的孕妇，可以通过注射RhD免疫球蛋白来封闭以自胎儿的RhD阳性的红细胞，以达到预防免疫产生抗-D的风险。所以当RhD阴性者有机会暴露于RhD阳性血液中的同种免疫反应时，如RhD阴性母亲怀有RhD阳性胎儿，在生产、流产（自然或人工）、羊膜穿刺或腹部外伤时，发生胎-母体间出血。类似的免疫反应也发生在RhD阴性者输入了RhD阳性红细胞时产生抗-D抗体，这种情况可注射RhD免疫球蛋白（Rhogam D Immunoglobulin，RhDIg）来预防二胎产生抗-D的风险。

新生儿Rh溶血性疾病是由于RhD阴性母亲的主动免疫作用，及母体在先前的分娩、流产、羊膜穿刺或腹部外伤时，RhD阳性红细胞进入了母体的血液循环；或者因输血（血小板）的关系（一般输红细胞可以找到RhD阴性红细胞，但经常找不到RhD阴性的血小板），造成母体产生免疫作用。所以RhD阴性的妇女，若检测无抗-D抗体，在分娩、流产、羊膜穿刺或输RhD阳性的红细胞或血小板时，可以先注射RhDIg来减小产生抗-D的概率。若无上述情形，RhD阴性孕妇在26~28周时，如检测无抗-D抗体则可以注射RhDIg，以及胎儿出生后72小时也可以追加一剂RhDIg。

注射RhDIg的原则：

（1）孕妇为RhD阴性。

（2）没有产生抗-D。

（3）有暴露于RhD阳性血液的风险。

RhD阴性患者在确定弱D检测阴性时需对其经济负担以及风险效益进行评估。如果没有经济负担，初筛为D阴性，没有产生抗-D，就可以建议注射RhDIg。若需进一步检测以决定是否注射RhDIg，建议进行弱D检测（weak D test）。若弱D检测阴性则注射RhDIg，若弱D检测阳性则可考虑不注射。但因为弱D检测阳性可能部分D（partial D）仍有可能会产生抗-D，所以也有专家建议弱D检测阳性者仍然需做注射RhDIg的预防措施。

弱D检测是阴性，也可能（有三分之一的概率）属于D _el亚洲型，目前循证认为就算这种D _el个体或孕妇，暴露于RhD阳性血或怀RhD阳性的胎儿并不会产生抗-D，故也有专家建议，若检测出D _el可建议不用注射RhDIg（图6-3）。

对于RhD阴性的孕妇是否要注射RhDIg的考虑因素较复杂，精简的考虑方式如下：

（1）若无须考虑经济因素，RhD初筛阴性（不论弱D检测阳性或阴性，也不论D _el或非D _el）可注射RhDIg。

（2）若进一步考虑，在RhD初筛阴性后即可进行 Del 1227A>G的基因检测，若 Del 1227A>G则不注射，若不带这个基因标志就注射RhDIg。

一般26~28周注射RhDIg，母亲血液里可以检测到抗-D抗体格局，这种RhDIg半衰期约6周，所以到孕龄40周时，大致已不会检测到或者还是有部分可检测到低效价的抗-D抗体。也有可能在刚出生的婴儿体内检测到游离抗体或直抗阳性，并能放散出抗-D抗体。但这些经冷乙醇分离法制备处理而成的免疫球蛋白在胎儿体内或母亲体内暴露于RhD阳性红细胞时并不会造成溶血性反应。

对于变异D，如何发报告及如何输血？

一般输血科常规RhD的检测（血液中心或血站针对献血者的RhD检测报告不适用此）结果报告原则如下：

（1）初筛D检测（使用IgM或IgM/IgG单克隆混株抗D试剂）≥2+，报告D阳性。

（2）阴性或无凝集，报告D阴性。

（3）凝集强度介于2+到无凝集之间，最近无输血且直抗阴性，报告D阳性，备注变异D或Dvar，建议输注RhD阴性红细胞。

变异D结果报告及输血流程如图6-4所示。