第二节　无标记生物医学传感器

无目标分子标记的生物医学传感器能够极大地提高应用潜力，并获得大量的信息。这种传感器可以实现原始分子实时结合过程的定量分析，以获得结合动力学参数，并能够使用无须处理的样品，实现床旁检测，达到分布式设备的高信息量的要求。由于不使用标记物，这种传感器主要是依赖于目标分子的固有特性，如通过阻抗、质量或折射率来检测结合过程。

一、力学生物医学传感器

力学生物医学传感器直接检测传感器表面结合的生物分子、病毒或细胞的质量变化。力学传感器代表了传感技术中最敏感的仪器，考虑到这个优势，力学生物医学传感器的研究大部分在于降低检测限，如用于检测非常稀有的分析物或称量单个病毒或细胞的质量。

声表面波传感器，包括石英晶体微天平，设计原理是压电晶体谐振对周围环境干扰的敏感性。在石英晶体微天平中，石英表面通常覆盖一层固定层用来固定生物受体。对贴附在石英表面的电极施加一个交流电压会激发机械共振振荡。通过记录传感器表面结合反应引起的振荡频率变化，能够得到信号，报道的检测限低至10pg/mm2。石英晶体微天平已经被用于检测蛋白、寡核苷酸、糖类、脂类、病毒和细胞的结合作用。

相对于电子和光学生物医学传感器，声表面波传感器的一个突出优势在于可以沉积在石英表面的材料很多。因为声表面波传感器的感受机制不依赖于光学信号传递或者光传播，所以可以使用多种材料来研究传感器界面的反应过程。但是声表面波传感器也不是没有限制性，虽然它可以在液体环境中进行反应实验，但是敏感性会降低，而且很难区分信号中质量、密度和黏度的影响。同时，虽然高密度的声表面波传感器阵列已有报道，但是它的制备还是非常困难的。

微纳米机电系统

国际上已经有研究团队尝试在微纳米传感器中使用力学传导机制以提高器件的敏感性，实现多路传输检测。这些设备使用标准光刻技术，由硅或氮化硅制备，可以实现器件大量制备以及与电子设备和流体腔池的集成。这些器件大部分是基于分析物与功能化悬臂梁的结合，这个过程要么改变悬臂梁的偏向，要么改变振荡的共振频率。静态器件具有能够在气体和液体中操作的优势，但是由于它需要一个分析物单层来实现悬臂梁的偏间，敏感度有所降低。然而，静态悬臂梁器件已被证明可以检测出12个碱基的DNA单链中单碱基对的错配、皮摩尔级检测限的寡聚核苷101以及纳摩尔浓度的蛋白质。静态器件可以从含有1mg/ml的BSM和HAS中检测出浓度低至0.2ng/ml的PSA，这个结果与酶联免疫吸法（ELISA）对PSA的检测结果一致，与生理浓度相符。动态器件具有极高的敏感性潜力，可以检测单个病毒、单个细胞、含有1587个碱基的DNA单链以及浓度低至10pm/ml的PSA。

二、电化学生物医学传感器

电化学生物医学传感器是通过检测电敏感元件的阻抗或电容变化来检测复合物结合或环境干扰的。最常见的实例就是那些被用来监测葡萄糖的电化学生物医学传感器。但是所有这种仪器（包括大多数用于其他方面的电化学生物医学传感器）均灵敏度不足，且需要电活性指示剂来激发可检测的电信号。电化学生物医学传感器能够实现低成本批量生产，对于功率的要求低，而且在尺寸上可以实现微型化和多通道，所有依然具有非常大的潜力。考虑到这些优势，还需要继续通过构建具有良好敏感性的纳米线、纳米管和纳米纤维的纳米器件来提高无标记电化学传感器的性能。

（一）微电极电阻抗谱

在生物医学传感器中，电阻抗谱可以测量到分析物与功能化电极结合所引起的电路阻抗变化。相对于伏安分析或电流分析，阻抗谱检测受到越来越多研究人员的青睐，主要是因为阻抗检测技术对生物功能捕获层的损伤比传统方法更小。阻抗谱检测中的电极已经可以实现微型化和多路传输。微电极的一个很大的优势在于当在电极两端施加电压或者电流时，会产生局部反应环境，这为实现多路传输复用方式的片上合成与功能化提供了可能。但由于无标记阻抗谱检测的低敏感性，在电极微型化方面存在一定的局限，能够实现生物分析的功能化表面积太小，以致不能在目标结合反应时激发出可测信号。

（二）纳米场效应晶体管

纳米电化学传感器主要是使用场效应晶体管，这种技术相对于前述讨论的阻抗谱检测中使用的电极，没有尺寸限制。在一个标准的晶体管元件中，一个半导体材料上附有一个源极和漏极，第三个被称为栅极的电极通过一个介质层与半导体分隔，并通过施加正负电压来控制半导体的电导。在这种方式下，栅极主要充当了从源极流向漏极的电流开关。在基于场效应晶体管的生物医学传感器中，生物分子被置于栅极之上，因此生物分子的结合反应会引起半导体的电导变化，也就是说源极与漏极之间电流的变化与结合反应相关。场效应晶体管传感器还对离子敏感，因此溶液中的离子会产生像栅极一样的作用而使敏感性大大降低。加上场效应晶体管本身构的弱性，限制了其可以使用的潜在样本与实验仪器。最后，生物分子对于电性影响的机制还不清楚，而且不同生物分子与传感器作用引起的响应与预期的生物分子的大小或浓度相关性并不理想。

三、光学生物医学传感器

光学生物医学传感器广泛应用于研究生物分子相互作用的无标记生物传感平台，因为这类传感器易于操作、敏感性高，而且产生的数据包含的信息量大。光学生物医学传感器的敏感性不会因为分析缓冲液的生理盐分与黏性而大大降低，因此适用样品的范围更大。使用光学生物医学传感器的无标记检测方法包括折射率检测、光吸收检测和拉曼光谱检测，其中最常用的是折射率检测。折射率检测是基于光对折射率改变的敏感性；生物分子的折射率比缓冲液大，如蛋白的折射率是1.45，而水的折射率是1.33，所以可通过相互作用后的光特性进行检测。已有多种基于折射率检测的光学生物医学传感器，包括表面等离子体共振、光纤、平面波导、干涉仪、光子晶体和共振腔。

（一）基于光细栅的传感器

光纤或者波导代替了棱镜的功能，将光与金属层耦合形成等离子共振波以及相对应的消逝场，用来感受介质中折射率的变化。在非表面等离子共振的结构中，光纤和平面波导则是依靠光与光栅结构的耦合。一个光栅由传感器表面的一个周期性物理干扰组成；光以特定角度、波长与光栅合，这些参数由光纤或波导的有效折射率（neff）以及光栅的周期决定。生物分子的结合会改变有效折射率，从而实现实时检测。在光纤器件中，光栅蚀刻在光纤芯或者直接包裹在光纤芯的包覆层里，这种由生物功能化的光栅作为传感区域。

光栅耦合平面波导的制备比较便宜，因为它是由一个沉积在玻璃基底上的薄膜波导组成，可以通过光刻或印刷技术将光栅刻蚀在玻璃基底上。光波导模式谱是这种传感形式下很有名的实现方式之一。这些传感器检测由光栅上折射率变化引起的耦合角变化。它们已被用于生物传感，包括对浓度低至100ng/ml的除草剂氟乐灵的抗体捕捉，对浓度低至0.5ng/ml的真菌毒素的检测。光波导模式谱也广泛用于研究不同材料表面的构造和生物分子吸附动力学。光波导模式谱不具有多路传输检测的性能，但是另外一个类似的使用平面波导光栅的技术——波长通信光学传感器，一个含有24个不同敏感点的器件已经被用于在牛奶中同时检测4类不同的家畜抗体，根据抗体的类型，检测限范围为0.5～34ng/ml。

（二）干涉型传感器

1.Mach Zehnder干涉仪

图5-2是Mach Zehnder干涉仪原理图。在Mach Zehnder干涉仪中，单频相关偏振光源被分为两路。样品放置在其中一个光路上，光与样品的反应会造成光的相位偏移，另一路光则作为参考。然后光会再合并，传感臂上样品引起的相位偏移会导致干涉，使光在强度上发生可以检测的变化。虽然传统的方法是在自由空间，Mach Zehnder干涉仪也可以构建在平面结构上，使用波导来分路与重组光线，称为集成Mach Zehnder干涉仪。在这样的仪器里，传感臂被功能化，样品的结合反应改变了波导的消逝场中的折射率，这样就对传播光的相位进行了调制，导致在与参考臂光线结合时产生干涉。集成Mach Zehnder干涉仪的第一个生物传感应用是使用固定的捕获抗体对人类绒膜促性腺激素进行检测，检测浓度低至50pmol/L。该器件的折射率检测限为5×10－6RIU，但是通过对Mach Zehnder干涉仪制备与分析过程的改进，检测限已降至10－7RIU，这与大多数表面等离子体共振器件具有同等水平。Mach Zehnder干涉仪还具有其他生物传感应用，包括对疫球蛋白的检测，检测限低至1ng/ml，及从浓度低至10pmol/L的突变基因序列中区分野生型DNA（58-mer）。Mach Zehnder干涉仪在多路传输化上存在困难，而且这类仪器需要比较长的敏感区域才能够激发出可检测信号。长的敏感区域不仅需要设备中大一点的封装，还会由于消耗增加而降低敏感性。

2.杨氏干涉仪

杨氏干涉仪可以像Mach Zehnder干涉仪那样被集成到芯片表面用于生物传感应用，图5-3是杨氏干涉仪原理图。与Mach Zehnder干涉仪相似，杨氏干涉仪将光用一个波导分为多个光路，其中一个是参考臂，但并不将光线重新合并成一个波导，而是使用一个CCD相机记录来自光输出的干涉条纹，这样就可以在单个参考的情况下实现多路传输传感。第一个用于传感的集成杨氏干涉仪出现在1994年，该技术有确定的折射率，检测限为10－7RIU。杨氏干涉仪随后被用在了多个概念性应用的实例中。例如一个含有3个样品臂和1个参考臂的多路传输设备实现了Ⅰ型单纯疱疹病毒的生物传感。值得一提的是，虽然有很多报道说明Mach Zehnder干涉仪和杨氏干涉仪的多路传输检测，但是干涉型生物传感并没有被证实能够稳定实现高通量多路传输检测，因为设备需要较大的感受区域，而且每增加一个敏感臂，分析的复性就会大大增加。

（三）谐振腔传感器

谐振腔代表了发展最快、最具潜力的一种无标记光学生物传感技术，其优点在于具有很好的敏感性，而且能被集成在多路传输芯片器件上。谐振腔传感器中包含微球体、微型环芯、微环和微毛细管，其中光线与一个限制特定波长的光学耦合；这种限制在透射谱上形成了一个狭窄凹陷。在谐振腔外环绕且能够同相返回的光线波长被称为谐振波长，这个波长可表示为：

λ＝2πrneff/m

其中λ为光的波长；r为谐振腔的半径；neff为波导模的有效折射率；m为整数。谐振腔的一个光纤或者总线波导向腔体提供光线进行耦合，并使光线离开腔体以进行透射谱记录。谐振波波长就如透射谱上的凹陷，因为谐振条件是在从光纤/波导到达检测器的光线中提取功率的。谐振波长对有效折射率的依赖性是随消逝场距谐振腔表面的距离而呈指数延伸和消减，正如其他光学传感器一样，正是这一关系形成了传感机制。通过改变有效折射率，生物分子在谐振腔的结合会改变该结构所形成的谐振波长。与前面提到的其他消逝场传感技术（如光栅耦合传感器和干涉器）相比，在其他技术中，每个光子与生物分子只作用一次，而在与谐振腔耦合的光子中，每次环绕谐振腔都可以与生物分子相互作用，在有些谐振腔中可达数千次。这个特性使得即使很小的器件也可具有很高的敏感性，而这在干涉仪等其他光学生物医学传感器中是不可能实现的。一个光子在消散前能够环绕谐振腔的次数与谐振器的品质因数（Q）相关，而且决定了设备的敏感性。根据方程

Q＝λr/δλr

其中Q是由谐振波长对应的共振凹陷的半高全宽（δ λr）决定的。因此，越高的品质因数（Q）对应越窄的透射谱凹槽，据此可以提高谐振波长的检测敏感性。生物医学传感器中使用的光学腔类型有微球体、微毛细管以及如微型环芯和微环等微加工芯片结构。

1.微球体和微型环芯

微球体的品质因数可达106，而且它的检测限可低至10－7RIU。共振腔微球体一般是通过熔融光纤或玻璃棒尖端构建，它必须被放置在锥形光线旁并与之对齐。共振微球体生物医学传感器研究实例已有很多，可用来检测蛋白酶活性，如对胰蛋白酶的检测限可达10－4单位/ml；可对甲型流感病毒颗粒检测并定量；对DNA中单个核苷酸不匹配的检测，检测限达6pg/mm2。用于DNA检测的器件使用了放置在单个锥形光线旁边的两个不同尺寸的微球体，因为尺寸不同，每个微球体都有一个特异性共振波长，而且能够同时进行通信。不考虑概念验证性研究的话，基于微球体的共振腔生物医学传感器与大规模多路传输是相排斥的，因为在微球体与锥形光纤之间需要敏感性校准，另外这些设备与平面制备技术不相容。

2.微型环

微型环的尺寸有一定的不同，但是几乎所有的直径都在数十微米级别，相较于需要1cm敏感长度的干涉仪设备而言就更受欢迎。微型环共振器并不会因为体积小而降低敏感性，因为共振腔可以使光反应次数增加。相较于微型球体与微型环芯，微型环的品质因子较低，记录的折射率检测限较高，但是它们制备简单且可批量制备，具有多路传输的功能以及与其他元件集成的潜力。微型环共振器可以使用标准硅微加工过程进行制备，可以通过片上总线波导实现多个微型环的被动校准，相较于微型球体与微型环芯而言这是一个很大的优势。由于这些器件普遍建立在硅基底之上，波导与微型环可以由聚合物、氧化硅、氮化硅制成。使用微型环共振器进行敏感性多路传输检测与结合分折是这种传感平台的优势体现。使用微型环共振器的器件在实验应用走向临床应用方面已有了很大进步。灵敏性高、制备简单、多路传传输以及具有集成潜力的特性结合，已经使基于微型环共振器的器件成为了生物传感领域中最具潜力的光学传感技术之一。

（四）表面等离子体共振与表面等离子体共振成像

基于表面等离子体共振的生物医学传感器是目前使用最广泛的光学生物医学传感器。表面等离子体共振检测是依赖于消逝场对电介质的局部折射率变化的敏感性，在大多数表面等离子体共振仪器中，消逝场是由光与金属膜调合产生的，表面与等离子模式相关，是通过棱镜形成的全内反射。形成全内反射的条件与金属薄膜耦合的光的波长、入射角随着金属表面介质的折射率改变而改变。一个流动池将生物分子传送到金属薄膜表面，在这里分析物与固定的受体结合，使局部折射率发生改变。仪器实时记录这个折射率的变化，并将该变化称为共振波长或者折射光强度的变化。传统的角度型表面等离子体共振比表面等离子体共振成像具有更好的检测限，表面等离子体共振的折射率检测限一般在10－8～10－6RIU，而SPHi的折射率检测限一般在10－6～10－5RIU，但是表面等离子体共振的每个光源每次只能检测单一区域的结合反应。表面等离子体共振成像使用CCD阵列检测整个芯片表面的反射光强度，能够实现阵列化，并能同时对多个结合反应进行传感，可以同时检测的反应数量仅由仪器的空间分辨率以及功能化的阵列密度决定。

基于这种高通量潜力，将表面等离子体共振成像作为多路传输床旁检测器件具有很好的前景。许多表面等离子体共振成像的研究已经利用它进行了多路传输的筛选与鉴定，而不仅是检测。角度型表面等离子体共振更倾向于进行高敏感性测量。表面等离子体共振成像的优势在于可以让用户根据功能化的位置定义不同的敏感区域，而且表面等离子体共振成像传感器芯片的金属表面比较坚固，这极大地减小了在对多路传输电化学或力学传感器进行设备功能化时所遇到的仪器校准的困难。作为一种生物敏感平台，表面等离子体共振金表面的生物功能化有大量的文献可供参考，它是在功能化和生物表面分析标准化方面最常见且理解最深入的表面之一。金最重要的特性就是具有生物相容性，并对硫醇基具有很强的结合力，这使得生物分子和无垢自组装单分子层易于结合。尽管有这么多优势，表面等离子体共振成像还是没有在临床或床旁检测中获得大范围应用。