第二节　电离辐射对细胞周期的影响

细胞自一次增殖分裂结束开始生长到下一次细胞分裂终了形成新的子代细胞为止，所经历的过程称为细胞周期（cell cycle）。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配到两个子代细胞中。细胞周期的全过程分为间期与分裂期两个阶段。

间期（interphase）阶段占据一个细胞周期循环中的大部分时间，为下一次细胞分裂做结构、功能和物质上的准备，如合成复制DNA、细胞体积增大等。间期又分为DNA合成前期（G₁期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G₂期）三期。

细胞分裂期（mitotic phase）又分为前期、前中期与中期、后期、末期，一般历时1~2小时。在此过程中，发生了染色体形成和姐妹染色单体分离、中心体、纺锤体、中体等亚细胞结构的连续动态变化，以及调节有丝分裂过程的一系列蛋白在特定亚细胞结构上形成功能或结构复合体及共定位变化（图1-2-1）。

图1-2-1　免疫荧光激光共聚焦显微镜观察

HeLa细胞有丝分裂过程中，磷酸化DNA-PKcs/pS2609与PLK1蛋白在中心体、着丝点、赤道板和中体等亚细胞结构上共定位

前期（prophase）自分裂期开始到核膜解体为止的时期，细胞染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体，在前期末核膜破裂，于是染色体散于细胞质中。两个中心体（centrosome）向相反方向移动，在细胞中形成两极。而后，以中心粒随体为起始点开始合成微管，开始形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。在此期，核膜开始瓦解离散成囊泡状内质网；前中期（prometaphase）自核膜破裂起到染色体排列在赤道板上为止；中期（metaphase）细胞变为球形，主要过程是纺锤体的最终形成，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点（kinetochore）上，46条染色体均移和排列到细胞的赤道板上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，包括22对常染色体和2条性染色体（XY或XX）；后期（anaphase）通过纺锤体微管的运动，着丝点纵裂，每一条染色体的两个姐妹染色单体分开，染色单体遂分为两组，并以相反方向朝各自的中心体移动。与此同时，细胞被拉长，并由于赤道板部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形；末期（telophase），染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁，内质网囊泡组合为核被膜。细胞赤道部缩窄加深开始胞质分裂（cytokinesis），最后完全分裂为两个二倍体的子细胞。

G₀期细胞是一群暂时离开细胞周期、停止增殖分裂亦不做分裂准备的处于静息状态（quiescence）的细胞。处于G₀期细胞，其细胞周期蛋白和周期素依赖性激酶消失、维系细胞周期运转的机器停止工作。G₀期细胞通常是终末分化的并执行特定生理功能的细胞。如肝细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞、神经细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。但是，在某种刺激或应急状态下，这些细胞可能会重新进入细胞周期。体外培养的细胞当生长因子或营养缺乏而处于饥饿状态时，便停止分裂而处于G₀期状态。对于具有接触抑制生长特性的正常二倍体细胞，在体外培养过程中随细胞的接触密度超过一定限度值，增殖速度下降，随即细胞增殖便停止下来，此时细胞就进入静息期。

值得注意的是静息期细胞与细胞衰老（senescence）都是停止增殖分裂的细胞状态，但两者存在实质上的差别。虽然许多G₀期细胞是随同组织器官而走向死亡，但并非所有的细胞进入G₀期是必定死亡的，只是由于缺乏任何的刺激而未能进入细胞周期中。细胞衰老就不同，它是细胞针对DNA损伤或降解所处的一种反应状态，致使一个细胞的后代丧失生存能力。另一点，细胞衰老不像静息期细胞，它是一种不可逆的细胞周期阻滞状态，直至细胞死亡。

细胞周期检查点（checkpoint）是细胞固有的一套暂停细胞周期进程、确保DNA结构完整性、DNA复制忠实性或姐妹染色单体分配准确性的内在检查机制。当细胞周期进程中出现异常事件，如DNA损伤或DNA复制受阻或纺锤体结构缺陷时，这类调节机制就被激活，及时地中断细胞周期的运行，待细胞修复损伤或排除异常结构故障后，细胞周期才能恢复运转。因此，细胞周期检查点与DNA修复机制一样，在维持细胞的基因组和染色体数目稳定性中发挥重要作用。但持续延长的细胞周期阻滞，将导致细胞死亡的发生。

按照细胞周期进程的运行时间顺序，可将检查点分为G₁/S期（边界）检查点、S期DNA复制检查点、G₂/M（边界）期检查点和M期（纺锤体）检查点（图1-2-2）。很显然，发生在两个时相之间的交界点（G₁/S，G₂/M）检查点分别是阻止细胞由G₁期进入S期，或由G₂期进入M期，避免受损DNA被复制或被转移给子代细胞。而S期检查点是因复制叉处DNA合成复合体受阻而引发的，M期检查点是纺锤体装配异常或结构受损如微管蛋白被破坏而引发。根据激活检查点的诱因和调控内容，可分为DNA损伤检查点（G₁/S、G₂/M、DNA复制检查点）和纺锤体结构检查点即M期检查点。

图1-2-2　细胞周期及DNA损伤检查点和纺锤体结构检查点

有关细胞周期检查点机制的认识，最初很多是来自啤酒酵母或裂殖酵母细胞模型系统，酵母细胞DNA受到损伤时，可通过几个检查点机制启动细胞周期延迟或阻滞。哺乳类细胞磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）家族成员，如ATM、ATR（AT和Rad3相关蛋白）和DNA-PKcs是调节能介导DNA损伤依赖的磷酸化事件，所不同的是ATM和DNA-PKcs主要是对DNA双链断裂损伤作出反应，即属于电离辐射损伤激活的PI3-K激酶；与此相反，ATR是被DNA大的损伤或复制叉受阻的信号如紫外线所致DNA损伤激活。高等生物与酵母细胞的另一个重要的区别是，p53蛋白在哺乳类细胞周期检查点的信号转导反应中发挥重要作用，而且无论是在DNA损伤诱导的暂时周期阻滞作用还是永久性阻抑反应直至凋亡发生，p53蛋白通过磷酸化激活多种信号转导蛋白或效应分子、扮演着不可替代的作用。而至今还没有发现酵母细胞存在类似p53蛋白的同源物。近期发现多个直接参与DNA修复的蛋白如BRCA1、DNAPKcs等在细胞G₂/M监测点和有丝分裂进程调节中发挥重要作用。如DNA-PKcs缺陷会导致受照细胞G₂/M检查点缺陷、纺锤体结构不稳定阻滞在M期。DNA-PKcs缺陷细胞在DNA损伤情况下，发生持续延长的M阻滞将导致细胞有丝分裂灾变死亡。

细胞增殖分裂过程中，不断有序的由细胞周期的一个时相进入下一个时相循环往返，周期素（cyclin）和周期素依赖激酶（cycline-dependent kinase，Cdk）在此过程的调控中发挥了主导作用。周期素是一类小分子蛋白，在细胞周期过程中以振动方式循环交替的表达和降解。周期素通过结合激活周期素依赖蛋白激酶，形成Cyclin/Cdk复合物，推动细胞周期进程。Cdk的激酶活性是通过其磷酸化和去磷酸化来调节，也就是说细胞周期进程变化主要是通过调控Cdk激酶活性来实现的。DNA双链断裂是电离辐射诱发细胞周期时相进程改变的关键因素或分子信号。

在细胞由G₁期向S期行进的调控中，CyclinD与Cdk4或Cdk6结合形成具有活性的复合物CyclinD/Cdk4/6，由其磷酸化pRB，促使转录因子E2F从pRB释放出来，激活CyclinE转录。CyclinE与Cdk2形成活性复合物，继而产生正反馈作用，进一步充分磷酸化pRB，增强E2F的释放，促使S期所需基因产物的大量转录生成，推动细胞由G₁期向S期行进。

细胞受照后推动G₁/S进程的功能机制受到干扰，出现G₁抑制。理论上，G₁抑制能使受照细胞获得时间来进行DNA修复。实验表明G₁抑制与细胞内p53基因的存在状态有关。例如，p53基因为野生型的正常小鼠成纤维细胞受2Gy或4Gy照射后，细胞呈明显的G₁抑制。如用同源重组技术造成染色体上的野生型p53双缺失，则照射后不发生G₁抑制。在p53基因单缺失的小鼠细胞中，照射后呈现中间程度的G₁抑制。又如在PKO细胞中原来表达的是野生型p53，照射后呈现G₁抑制，如果细胞转染了突变型p53基因，则G₁抑制减弱。目前已发现多个下游基因受p53的转录调控，如Mdm2、p21^CIP、Gadd45、Bax、Fas等。Mdm2蛋白通过与p53蛋白的氨基端结合来介导后者通过泛素化-蛋白酶体途径降解。

p21^CIP是现实p53的G₁/S阻滞调节功能的关键分子。p21是CDK抑制因子，其转录受p53调控。在正常细胞中p21与增殖细胞核抗原PCNA、周期蛋白和CDK以四聚体形式存在，参与G₁/S转换的调节。在通过基因剔除技术得到的p21缺失的小鼠上，辐射诱发的G₁抑制明显减弱。

现已基本明确，G₁细胞发生DNA损伤时，至少可通过有两条机制途径激活G₁/S期检查点，现实G₁期阻滞。

ATM/p53/p21^CIP途径是通过调节p53蛋白和其负调节分子Mdm2磷酸化来实现的。DNA损伤信号激活ATM，ATM一方面磷酸化p53和Mdm2，使两者解离，从而阻止了p53蛋白出核和泛素化降解。另一方面，ATM磷酸化激活Chk2，后者也可磷酸化p53，增加稳定性。p53蛋白水平上升，激活包括p21^CIP在内的靶基因的转录。而p21^CIP是Cdk抑制剂，能与CyclinE/Cdk2和CyclinD/Cdk4/6复合物结合，从而阻滞细胞的G₁/S期进程。此调节过程涉及基因转录的激活，通常需要2~3h才能实现，因此，是一个慢的细胞周期调节机制。

ATM/Chk2/Cdc25a途径是通过磷酸化和泛素化等翻译后修饰机制实现的，是一个快速调节反应。ATM磷酸化激活Chk2，后者磷酸化并摧毁磷酸酶Cdc25a。在细胞正常生长状态下，Cdc25a能去除Cdk2分子中Thr14和Tyr15位点上具有抑制作用的磷酸化，从而维持Cdk2的激酶活性。DNA损伤后，通过ATM/Chk2途径磷酸化的Cdc25a被降解，Cdk2分子因保持有Thr14和Tyr15的磷酸化而失活，导致细胞G₁/S阻滞。

细胞在DNA复制过程中受到照射，DNA损伤导致DNA合成机器受到抑制或DNA复制过程受阻引起细胞通过S期的时间延长或S期阻滞。引发S期阻滞的DNA受损可以是DNA链断裂、DNA交联或加合物等多种形式，为了使DNA受损伤细胞能以DNA完整分子结构形式继续DNA的复制，由S期检查点构成的监视网络通过信号转导使细胞延迟S期的进程，直至受损DNA得到修复。

电离辐射对DNA合成的抑制作用呈双相剂量反应，在较低剂量时DNA合成速率下降较快，反映了辐射敏感成分。随后的速率曲线下降较为平坦，反映了辐射抗性成分。进一步的研究证明敏感部分是由于复制的抑制子引发的抑制，而抗性部分是体现了DNA链的延长活性的辐射响应。

ATM、NBS1和MRE11都是细胞DNA损伤信号识别和信号转导反应的重要调节分子，其中NBS1、MRE11与RAD50是以复合物MRN的形式存在和发挥生物学功能，包括参与DNA双链断裂修复反应。ATM基因缺陷的共济失调性毛细血管扩张综合征，以及Nbs1或Mre11基因缺陷的Nijmegen断裂综合征（NBS）或AT样综合征（ATLD），除都对电离辐射敏感外，还有一个共同的表型特点，即辐射抗性DNA合成（radioresistant DNA synthesis，RDS）。如前面所述，通常情况下细胞受照后，DNA合成很快受到抑制，而ATM或Nbs1、Mre11缺陷的细胞具有显著的抵抗辐射对DNA合成的抑制作用，说明这些基因产物在电离辐射损伤细胞的S期检测点中发挥重要作用。ATM与MRN复合物在DNA损伤反应中存在比较复杂的相互调节的关系：一方面，MRN在DNA损伤后就会很快地以不依赖于ATM的方式聚集到DNA双链断裂位点，形成聚焦点。而且，MRN募集到DNA损伤位点是ATM的激活所必需的，特别是在低剂量照射的情况下；另一方面，MRN又是ATM的直接磷酸化靶分子，其中NBS1分子中有多个ATM磷酸化位点，这些位点的磷酸化，对介导S期和G₂/M期检测点功能都非常重要。

ATM可通过以下三条平行途径介导细胞S检查点。

Cdc25a磷酸酶能催化周期素依赖激酶Cdk2去磷酸化而被激活，在活性Cdk2的介导下，Cdc45被装载到复制起始点（replication origins），这个步骤是募集DNA聚合酶、促进MCM介导的复制起始点解螺旋、启动DNA合成代谢所必需的。细胞受照损伤，ATM被激活，进一步磷酸化激活Chk2，后者磷酸化Cdc25a的Ser123位点，导致其降解，Cdk2因不能被去磷酸化而失活，最终DNA合成被抑制。

SMC（the structural maintenance of chromosomes）蛋白家族几乎参与染色体生物学的全部过程，对维持基因组稳定性非常重要。其中的SMC1/SMC3在S期检查点机制中发挥作用。辐射DNA损伤能通过ATM-NBS1信号途径诱导SMC1的Ser957和Ser966位点及SMC3的Ser1083位点磷酸化。SMC3的Ser1067位点是一个组成型磷酸化位点，是CK2的底物。虽然Ser1067的磷酸化水平不会受到电离辐射作用而进一步的上升，但对于辐射诱导的Ser1083位点的磷酸化是不可或缺的。Ser1067位点突变同样会导致细胞S期检查点功能的缺陷。SMC1/SMC3是如何抑制DNA合成的具体机制尚不清楚。

有研究报道，细胞受照后，MRN通过与复制蛋白A（RPA）的相互作用被募集到复制中心位点，抑制DNA复制起始。RPA是与MRN复合物中的MRE11发生直接的相互作用。RPA是募集DNA聚合酶α/引物酶以及复制因子C转载PCNA到达引物复制起始点所必需的。电离辐射作用下，通过ATM磷酸化MRN，可能会导致MRN/RPA的构象改变，进而抑制RPA的复制起始功能。另一个可能性是，磷酸化MRN干扰了RPA/MRN在复制起始点与其他复制因子的结合，导致DNA复制抑制。

CyclinB1/Cdk1是牵引细胞由G₂期进入M期的关键复合物。在活性CyclinA/Cdk2的引导性，调控CyclinB1的转录因子被周期素依赖激酶激活，促使CyclinB1的转录生成。CyclinB是在S期开始生成，G₂后期达到高峰。

CyclinB1/Cdk1的活性是受到激酶与磷酸酶的反向反馈环的严密调节。①在G₂期，受Wee1和Myt1激酶的作用，Cdk1的Tyr15和Thr14位点被磷酸化，此时的CyclinB1/Cdk1是处于非活性状态；②为促使细胞由G₂期向M期行进，在磷酸酶Cdc25的催化下，Cdk1去磷酸化而被激活。

电离辐射诱发哺乳动物细胞G₂/M期阻滞在照射2~4小时左右出现，8~12小时左右到达高峰，24小时基本恢复正常。照射剂量越大阻滞越明显，恢复时间越晚，甚至不能恢复直至细胞死亡。不同来源细胞系的细胞周期阻滞程度和恢复的时间也不一致。此外，一些参与调节G₂/M期进程的基因功能的缺失如PLK1、ATM、Chk1缺失会改变细胞周期对电离辐射损伤的反应性。4Gy照射HeLa细胞后4h左右出现G₂/M期阻滞，12小时左右到达高峰，24小时基本恢复正常。但当DNA、DSB修复关键分子DNAPKcs的表达被其特异的shRNA分子沉默后，或激酶活性被其特异化学抑制剂及Nu7026抑制后，G₂/M阻滞显著延长，照射后48小时也未恢复（图1-2-3），而且其结局是发生有丝分裂灾变死亡。由此揭示了DNA-PKcs的偶联DNA修复与细胞周期阻滞的生物学功能。

图1-2-3　4Gy γ射线照射诱发HeLa细胞周期阻滞

G ₂/M期阻滞及DNA-PKcs表达被shRNA沉默或活性被NU7026抑制后的增加作用

由于G₂细胞和M期细胞的DNA含量是相等的，普通的流式细胞技术无法区分开，需要借助M期细胞的分子标志物来标记M期细胞，如Ser10位点磷酸化的组蛋白H3（H3-pS10）是有丝分裂中期（metaphase）分子标记物，以pH3抗体作免疫荧光标记，结合流式细胞术就可实时检查到细胞周期过程中M细胞含量的变化，分析细胞G₂/M检查点功能。HeLa细胞在4Gy照射后2小时就可观察到M细胞比例显著降低，表明细胞启动了G₂/M期检查点，使细胞阻滞在G₂期，约4~6小时M期细胞比例下降到最低点，8小时左右阻滞被逐渐解除，大量的G₂细胞进入M期，并阻滞在M期。

在DNA损伤信号刺激下，ATM及DNA-PKcs被激活，继而磷酸化激活Chk2，后者磷酸化Cdc25，促使其由细胞核向胞质转位而失活，导致CyclinB1/Cdk1处于非活性状态、G₂/M期阻滞。

上述G₁/S、S期和G₂/M期检查点是由DNA损伤直接诱发的，被称为DNA损伤检查点。纺锤体检查点又称为结构检查点，是细胞感应到纺锤体结构异常如染色体在赤道板处的排列异常、纺锤体丝纤维在着丝点处的异常附着或缺如、游离染色体等而引发的检查点机制。纺锤体或M期检查点是确保姐妹染色单体能均等和准确地分裂和分配到两个子细胞，维持细胞的染色体结构和数目稳定性。

有丝分裂激酶Auroras是M期检查点的关键性调节分子之一，参与了包括中心体分裂、二极体纺锤体的形成、染色单体分裂和胞质分裂等有丝分裂的全过程。人类有Aurora A、B、C，Aurora A蛋白水平和激酶活性在G₂期就达到高峰，直到M期过程的结束。在M期中，TPX2与Aurora A结合，阻止后者分子T-环位点的pT288被磷酸酶PP1去磷酸化，保持Aurora A的激酶活性。PLK1也是一个参与M期全过程调节的激酶，能介导TPX2磷酸化，由此维持Aurora A的活性状态。细胞受到照射后，TPX2蛋白被快速降解。而且电离辐射还能选择性地抑制TPX2的蛋白翻译活性。其结果导致Aurora A失去与TPX2结合的机会而发生T-环pT288位点去磷酸化，由此失去活性，导致细胞M期阻滞。除此以外，DNA-PKcs、PLK1、ATM、Chk2等失活，也会导致电离辐射诱发的M期阻滞延长，甚至细胞发生有丝分裂灾变死亡或凋亡。