第六节　放射性肺损伤模型

放射治疗是胸部肿瘤治疗的常用手段之一，肺癌、乳腺癌、食管癌等胸部恶性肿瘤的临床放射治疗过程中，周围正常组织不可避免地会受到射线照射。正常组织的放射性副反应成为限制照射剂量提高的重要因素，其影响患者生活质量，严重时可造成患者死亡。肺是中晚期反应组织。在胸部照射后，最主要的剂量限制性副反应就是放射性肺炎和肺纤维化。急性肺炎主要发生在辐射暴露后2~6个月，而肺纤维化在辐射暴露后几个月才开始出现。患者会出现进行性加重的呼吸功能障碍。在将放疗与某些化疗药物联合应用时，肺组织的辐射耐受性会有所减弱。

放射性肺损伤的常见病理过程包括：①渗出期，见于放射后1个月内，镜下可见肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞脱落，肺泡毛细血管受损，通透性增强，血浆蛋白渗出；②肉芽生长期，肺泡腔变小，肺泡壁中度增厚，壁内可见多种细胞成分；③纤维增生期，见于放疗后3~6个月，肺泡明显缩小，纤维及成纤维细胞增多，并由纤维蛋白样物质出现；④胶原化期，发生在放疗后6个月以上，局部肺泡壁完全被胶原组织取代，肺泡极度萎缩甚至消失。

放射性肺损伤可引起高热、呼吸困难、剧烈咳嗽，严重者出现呼吸衰竭甚至危及生命，因此基于放射性肺损伤动物模型来探讨其发生机制对于指导临床肿瘤放疗及急性放射病防护与救治具有十分重要的意义。

目前在临床前研究中，小鼠是最常用的也是最能反映人类放射性肺损伤发病机制的动物之一。在将小鼠应用于该类损伤的建模过程中，最应注意的就是品系的选择问题。不同品系的小鼠在电离辐射所致肺部损伤的严重程度以及组织病理改变方面有相当大的差异。这种品系差异最早是由Julian Down和Gordon Steel在1983年对比CBA以及C57BL小鼠时发现的。在20世纪八九十年代CBA和C3H品系小鼠是放射性肺损伤研究中最常用的动物。其后，Franko等人对比了9种品系的小鼠的放射性肺炎和肺纤维化倾向。正是受到这些研究结果的影响加之C57BL/6小鼠具有比较清楚的遗传背景方便基因操作以及较低的价格等特点，该品系小鼠后来逐渐成为了研究放射性肺损伤分子机制和药物治疗策略的标准动物。

但是近几年C57BL/6小鼠在放射性肺部损伤模型中的地位有所动摇。该品系小鼠从接受电离辐射至出现肺部纤维化的时间间隔过长（6~9个月），放射性肺炎较轻微且会出现明显的胸腔积液。人类在辐射暴露后出现胸腔积液的情况报道较少，且其与死亡率的相关性较小。人类、非人灵长类动物以及不同品系小鼠发生严重放射性肺损伤的剂量效应关系差异较大。小鼠的剂量效应呈现明显的品系相关性。C57L品系小鼠在较低剂量时症状出现的潜伏期以及照射剂量与人类、非人灵长类发生放射性肺炎的时间和剂量可很好的吻合。

肺的辐射耐受剂量与受到照射的体积明显相关。临床上患者接受全肺照射的病例较少，大多数为治疗肺癌、乳腺癌、食管癌等疾病时照射野内正常肺组织受到照射的情况。但是在使用小鼠的实验研究中，进行小体积的均匀照射比较困难。通常可进行右侧胸部照射，而将另一侧肺部作为未受到照射的对照组。Dabjan MB等的统计发现，95%使用小鼠的研究将全肺纳入了照射野。这些研究的照射范围分为全身照射、半身照射、全胸照射等几类。

除了小型啮齿类动物，放射性肺损伤的研究也可以使用如猪、狗以及非人灵长类的大型动物。猪的肺部生理功能与人类很相似，但是使用猪作为实验对象的研究较少。狗的肺部生理功能与人有一定的差异性，大部分研究选择了吸入性的放射性核素来建模。非人灵长类由于其特有的与人类相似性成为合适的放射性肺损伤实验动物，但是上述动物模型实验操作难度大，价格昂贵，并不是目前的首选动物。

C57L、CBA、C3H品系小鼠是具有肺炎发生倾向的，它们是相对来说更能代表人类全肺辐射暴露后损伤疾病进程的动物。虽然在放射性肺损伤动物体内可以检测到明显的细胞因子和生长因子的表达上调，但是目前尚无某个特定因子直接起作用的证据。转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）会引起组织强烈的炎性反应，刺激结缔组织生长，抑制上皮细胞生长，其与肺纤维化有关。Franko A J等人的研究表明相对于C3HeB/FeJ小鼠，C57L小鼠在受到射线照射后会出现较高的TGF-β的表达以及明显的肺纤维化。此外，可能与肺损伤相关的因子还有肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素等。但是仍需更多的研究来阐明它们在放射性肺损伤的发生中所起的作用。

最常见的雄性C57BL/6J小鼠为例，阐述放射性肺损伤模型的建立步骤与常见检测指标。选取8~12周龄的雄性C57BL/6J小鼠，体重25~30g，常规饲养。将小鼠放入与体型匹配的有机玻璃固定装置内，使其保持清醒状态且固定身体，四肢平铺，呈仰卧位。应用直线加速器经前胸局部照射全肺一次，照射野为4cm×1.8cm，其余部位以铅板屏蔽。射线种类为6MV X线，剂量为10~20Gy，剂量率为200cGy/min，源皮距为100cm。

记录照射后小鼠精神状况及饮食饮水、活动能力、体重变化、皮毛光泽、有无呼吸困难，呼吸频率加快，胸廓膨隆等情况，按实验所需时间点采集小鼠肺组织鼠肺，大体观察肺组织颜色、弹性、有无出血、充血、水肿等表现。肺组织受照后呈现出血、充血、水肿等多种病理改变，见图3-6-1。

图3-6-1　肺组织受照后大体病理改变

显示肺组织受照后呈现出血、充血、水肿等多种病理改变

按实验所需时间点采集小鼠肺组织，HE染色检测小鼠肺病理改变，显微镜下观察肺泡壁结构、厚度，血管结构与密度，肺泡大小与腔内渗出、胶原纤维沉积、成纤维细胞聚积情况。肺组织受照后呈现肺泡壁增厚、腔内渗出、胶原沉积等多种病理表型，见图3-6-2。

图3-6-2　肺组织受照后HE染色及马森三色染色

肺组织受照后HE染色及马森三色染色显示肺泡壁增厚、腔内渗出、胶原沉积等多种病理表型

炎症检测主要是按实验所需时间点采集小鼠眼眶血，采用酶联免疫吸附测定法检测炎性因子，如TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、I型干扰素、转化生长因子（TGF-β）等。

虽然放射性肺损伤的研究有较长的历史，但是防治药物的基础研究成果向临床的转化率却十分低。其中一个原因就是缺乏非常有代表性的动物模型。理想的放射性肺部损伤动物模型应在辐射暴露后能在剂量-效应、自然病程以及损伤后的组织病理方面高效模拟人类疾病进程。目前在临床前研究中，小鼠是最常用的也是最能反映人类放射性肺损伤发病机制的动物之一。在将小鼠应用于该类损伤的建模过程中，最应注意的就是品系的选择问题。不同品系的小鼠在电离辐射所致肺部损伤的严重程度以及组织病理改变方面有相当大的差异。

在放射性肺损伤的研究中，动物死亡率是一项重要的观察指标。这一指标呈明显的剂量依赖性。一个有趣的现象是，在相同的照射剂量下，雄性C57BL/6小鼠的中位生存期比雌性小鼠明显延长。但是在其他品系小鼠中并未发现明显的与性别有关的辐射耐受性差异。在使用C57BL/6小鼠作为实验对象的研究中，许多研究者将动物的死亡归因于后期的肺纤维化。事实上，肺纤维化和肺部辐射暴露后动物死亡之间可能关联性并不强。如果进行放射性肺损伤防治手段的研究，不能仅仅将降低动物死亡率作为唯一评判标准。而且有关死亡率的研究不能过早结束。因为过早的结束实验容易导致研究者无法判断在最终时间点观察到的动物死亡率的降低到底是由于药物真正起到了治疗肺损伤的作用还是仅仅因为动物死亡的时间被推迟至观察时间点之后。除了组织病理学研究外，我们还可以使用CT和呼吸频率等非侵入性手段代替死亡率来评估放射性肺损伤。