1.新冠肺炎核酸检测对确诊的意义何在？

施毅（2月11日）

新冠肺炎实际上就是CAP的一种，引起CAP的病原体包括细菌、病毒、非典型病原体，那么对CAP患者应该何时、采集哪些标本、进行哪些实验室检查？《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）》有明确规定。通常情况下，门诊患者不需要进行病原学检查，但特定情况下和住院患者，应该进行相关的实验室检查。指南中有非常明确的CAP特定临床情况下建议进行的病原学检查。需要进行呼吸道病毒筛查的患者有五种情况：群聚性发病、初始经验性治疗无效、重症CAP、双肺多叶病灶和免疫缺陷。

临床高度怀疑病毒性肺炎时，应考虑进行相关的病毒学检测。目前推荐的检测共有4种，包括病毒分离培养、血清特异性抗体检测、病毒抗原检测和核酸检测。病毒分离培养非常困难，在临床上一般都不用病毒分离培养作为临床诊断的标准，一般只有在实验室进行研究时才进行病毒分离培养。血清特异性抗体检测包括IgM和IgG，前者出现时间较短，后者通常要有恢复期血清，对新冠肺炎诊断的价值有限。所以实际在临床应用的诊断中，病毒性肺炎的指标主要有两个：一个是病毒抗原检测方法，包括直接免疫荧光法（DFA）和胶体金法检测，使用胶体金法比较多，虽然胶体金法的特异性比较好，但是敏感性并不高；另一个是核酸检测。在对甲型流感的诊断中，实际临床应用的主要方法是病毒抗原检测（如胶体金法检测）和核酸检测。所以核酸检测是非常重要的。

在新冠病毒检查方法中，首先在所有六版诊疗方案里，毫无疑问都把核酸检测作为确诊病例的实验室诊断标准，只是从早期的呼吸道标准，扩展为呼吸道与血液标本，阳性指的是在鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新冠病毒核酸。到第六版已经不再考虑标本来源，只要核酸检测阳性即可确诊。方法为：①实时荧光RT-PCR检测新冠病毒核酸阳性；②病毒基因测序，与已知的新冠病毒高度同源。

核酸检测是不可替代的确诊方法：对合理应用有限的医疗资源、及时救治患者非常重要。第一，病原抗体检测有窗口期，要在后期才能出现抗体，往往滞后于核酸检测。第二，核酸检测的敏感性要远远高于刚才提到的其他实验室检测方法。第三，核酸检测阳性要比胸部CT出现改变更早，我们现在已经发现存在无肺炎临床症状表现的新冠肺炎患者，所以它显得更加重要。第四，有核酸定量检测，这种定量检测可以动态监测病毒感染的程度，观察治疗效果。

PCR检测方法实际上是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，是对起始模板进行定量分析的方法。现在已经有很多应用在临床的实时定量PCR检测试剂盒。大家一定要注意，PCR方法虽然非常敏感，但是实际针对某一病原体其阳性检出率也只能达到30%~50%，超过50%的诊断需要依赖临床诊断病例，本次新冠肺炎的诊断也是如此。

基因测序大家也比较熟悉了，下一代基因测序技术（NGS）的广泛应用已经使大家对病原学基因测序非常了解。基因测序是通过对标本的基因进行测序，如果与已知的2019-nCoV基因高度同源即可确定。这个方法非常准确，可用于争议样本的最终确认、监测病毒的变异、病毒的溯源等，但是成本较高，操作较复杂，需要测序仪和专业的生物信息分析等。

基因测序的好处有哪些？第一，与PCR相比，因为病毒在传播过程中可能发生变异，这时候PCR就检测不出来了，但是高深度宏基因组测序（测序总reads数不低于80M DNA序列）可以弥补RT-PCR的缺点，并监测可能的变异；第二，部分病毒含量较低的样本，低于RT-PCR最低检出限，而人源宿主背景较低时，宏基因组测序可以有效提高检测阳性率；第三，对于冠状病毒检测阴性的疑似感染，宏基因组测序能够有效提供其他可能感染的病原信息；第四，宏基因组测序还能够提供多重感染或继发感染相关病原信息。

PCR方法操作便捷、速度快、成本较低，更适合于大批量患者的检测。而NGS花费高、时间长，对于大批量检测来说，比较难以承受。所以作为普查，还是使用PCR方法比较合适。但是，如果患者在检测过程中遇到问题，比如一次检测为阳性，但下一次检测又呈现阴性，那么此时就应该介入基因测序；如果患者临床症状比较典型，检测结果转阴了或测不出来，是不是有基因发生了变异，我们现有的PCR试剂盒检测不出来，就应该使用NGS。另外，如果是重症患者，怀疑同时有混合感染，他很有可能不仅是有新冠病毒，同时也可能有其他病毒甚至细菌感染存在。特别是患者如果存在免疫功能低下，比如糖尿病、使用免疫抑制剂的人群，这样的患者可能同时需要做NGS。如果我们这样把握，就不会让所有患者都去做NGS，又可以掌握一定的尺度，因为NGS还是比PCR方法有更多的优点。

如果结合RT-PCR和宏基因组检测，可更快、更全面地覆盖2019-nCoV检测，并监测新冠病毒在传播过程中可能发生的变异。

陈荣昌（2月29日）

有很多人讨论关于新冠肺炎的诊断标准。要确诊的话，肯定要进行病原学检测，否则不好鉴别其他呼吸道病毒（如流感病毒、腺病毒等）导致的肺炎。尽管现在有典型影像学改变，但是总体而言，病原学检查最重要的还是诊断和鉴别方法。但现在病原学检测的阳性率只有30%~40%，这就需要临床医生综合考虑流行病学、临床影像学以及动态变化，不要轻易因为上呼吸道标本检查结果为阴性而排除。这时，就特别需要呼吸与危重症医学科综合诊治的基本功。动态观察和反复检查可以提高确诊率。

如图3-1所示，左侧为流感病毒肺炎，右侧为RSV肺炎，我们能够从影像学推断出病原体吗？尽管最近大家都关注一篇综述性的文章，论述病毒性肺炎的影像学改变，似乎不同的病毒性肺炎的影像学具有自身的特点，但是特异性不高。我认为还需要建立一套面向临床需求的病毒学检测方法，才能够更好地指导临床诊断与鉴别。

对于很多肺炎来说，过去大家主要关注细菌感染，因为病毒性肺炎是一个自限性疾病，所以病毒检测并不是常规检查。但是我们之前遇到一个重症肺炎导致ARDS的病例，进行气管插管机械通气，插管过程中有血性痰液。患者白细胞正常、淋巴细胞减少，降钙素原正常，看上去很像病毒感染，但是流感病毒快速检测（胶体金）阴性，可医生觉得还是有点像病毒感染，于是经验使用了奥司他韦。在这种情况下，我们到底是考虑常规抗病毒治疗还是积极的病原学检测。后来，该患者的PCR检测结果为流感病毒阴性，腺病毒阳性（多次）。我们知道奥司他韦对腺病毒无效。因此，我认为，针对这类患者，如果不做病原学检测，就容易导致我们的诊断不明确，治疗的针对性也不够强。