实验五　使用显微拉曼光谱仪分析纤维分子结构

一、实验原理

（一）拉曼光谱基本原理

具有一定波长的光照射到气体、液体或透明晶体的样品上，大部分按原来的方向透射而过，小部分按照不同的角度散射开来，这种现象称为光的散射。散射是光子与物质分子相互碰撞的结果，由于碰撞方式不同，光子和分子之间会有多种散射形式。

若光子和分子之间在碰撞时发生能量交换，不仅使光子改变了其运动方向，也改变了其能量，使散射光频率与入射光频率不同，这种散射称为非弹性散射，也叫拉曼散射，强度很弱，大约只有入射光的百万分之一。

许多物质经光照后会产生荧光，荧光和拉曼散射是有区别的。从图1-5-1的能级示意图上来看，处于基态的电子经光照后跃迁到激发态，然后从激发态落到最低激发态，再进一步回落到基态，这个过程所释放出来的能量就叫作荧光。拉曼散射则不同，它是电子基态受激跃迁到一个虚态（并不是实际的电子激发态），然后回落到电子基态，整个过程所释放出来的能量叫作拉曼散射。拉曼散射包括斯托克斯散射和反斯托克斯散射。散射光频率小于入射光频率的散射被称为斯托克斯散射；而散射光频率大于入射光频率的散射则被称为反斯托克斯散射。拉曼散射中大部分研究的是斯托克斯散射，即激发波长比发射波长短。由于荧光之间的能级差是固定的，在实际测试过程中，可通过改变激发波长来确定是拉曼散射还是荧光。不管用哪个激发波长去激发样品，如果样品能发射荧光，荧光的波长不会改变；但如果是拉曼散射，波长会发生改变。

拉曼光谱表征的是物质的本质特征，也就是表征化学键之间的结构，所以不同物质之间即使只有很微小的差别，拉曼的谱峰都会有非常明显的变化。以同素异构体为例，虽然元素相同，但结构不同，拉曼谱峰就明显不同。对于普通的物质，如果受到挤压，它的拉曼谱峰会发生位移，这是由于物质本身的结构受到应力作用而产生变化。拉曼光谱的谱峰中有半宽高这个参数，不同物质具有不同的结构，所测得的拉曼谱峰的半宽高有的偏窄有的偏宽，这个宽窄表征的是物质的结晶度，半宽高越窄，结晶度越高。此外，拉曼光谱中还包含一个重要的信息——谱峰强度。某一样品若包含几种不同的物质，则可通过谱峰强度对其进行定量分析。拉曼光谱还可以对样品进行成像分析，在样品的某个区域内做成像，用不同的颜色来表示不同的物质，反映物质的分布情况。

（二）显微拉曼光谱仪工作原理

图1-5-2给出了显微拉曼光谱仪的整体构造。激光器发射出激光线，但其本身不是很纯，激光线中含有一些杂线，因此需要加设一个干涉滤光片来过滤杂线，起到纯化激光线的作用。纯化后的激光线经过功率衰减片，其作用是调节激光强度至合适的功率，以免太强功率的激光把样品烧坏，影响测试。衰减后的激光经过两个反射器，激光光路发生改变，打到瑞利滤光片上。普通滤光片是让光路缓慢上升，而瑞利滤光片可以让光路以非常陡的坡度上升。瑞利滤光片不会让激光透过去，而是将其反射出来打到样品上。样品放置于显微镜下方，通过显微镜对焦，可以确定所需测试的样品位置。激光打到样品上，样品发出拉曼信号，瑞利滤光片会让拉曼信号通过，再经过一个反射器改变拉曼信号方向，使其通过共聚焦针孔。共聚焦针孔的大小决定了样品上收集信号的区域。狭缝的作用是抑制杂散光，拉曼信号通过狭缝后到达光栅上进行分光。最后拉曼谱图呈现在CCD（Charge-coupled Device，电荷耦合元件）上。

二、样品准备

显微拉曼光谱仪对样品的形状、状态没有特殊要求，因此制样比较简单。由于玻璃不会吸收拉曼散射光，因此可以将试样放置在各种玻璃制成的样品池中进行拉曼光谱测试。

1.固体　固体样品，不管是粉末状、片状、纤维状，或者其他不规则形状，都可直接用双面胶固定在载玻片上。特别说明一点，粉末状样品考虑到颗粒间空气的信号可能会呈现在样品中，建议压片后固定到载玻片上，这样也能防止粉末污染物镜镜头和其他样品。

2.液体　液体样品的制备相对复杂一点。对于有毒、易挥发的液体，为了保护物镜镜头，最好封装在毛细管或者比色皿中；其他的液体可以滴到金属表面，也可以放置于石英比色皿、96孔板或液体样品池。

3.气体　气体样品最好能压缩后封装在密闭的样品池中，因为气体分子太疏松，不易被激光打到，产生的拉曼信号也相对较弱，检测起来较为困难。

三、实验仪器简介

本实验使用的仪器为日本HORIBA的显微拉曼光谱仪，如图1-5-3所示。该仪器主要由激光器、干涉滤光片、功率衰减片、反射器、显微镜、样品台、瑞利滤光片、共聚焦针孔、狭缝、光栅和CCD组成。

本台拉曼光谱仪配备了3个激光器，分别是532nm、638nm、785nm。激光器和干涉滤光片是配套的，每个激光器都有它固定的干涉滤光片。显微镜配备了3个物镜，分别是10倍的物镜、50倍的长焦和100倍的物镜。共焦针孔和狭缝均设定了3个可选值，共焦针孔大小分别为100μm、300μm和500μm；狭缝大小分别可选50μm、100μm和200μm。本仪器还有4个光栅可选，分别为600gr/mm、1200gr/mm、1800gr/mm和2400gr/mm。

四、实验操作步骤

（一）光谱校准

由于拉曼光谱仪的光路十分精细，也很容易受到环境温湿度、测试操作等的影响，每天首次测试前必须先对光栅进行校准。硅片的拉曼谱峰只有一个，并且谱峰强度很高，因此选为校准光栅的标准品。

1.制样　将硅片用双面胶粘到载玻片上，放置于样品台上，并用样品夹固定。

2.对焦　双击打开计算机桌面上的软件LabSptc6，选择Viewing模式，此时软件上显示显微镜下的样品图片（图1-5-4）。选择10倍的物镜，粗略对焦；切换到50倍场焦，并对焦至图像清晰。显微镜下的图像可在右侧Display选项卡中按需设置图像的显示属性。确定好测定位置后点击软件右上方红色的“Stop”按钮，切换到Raman测试模式。Viewing模式和Raman模式的相互切换在仪器上会有相应指示。

3.参数设置　Raman模式下进行参数设置，设置界面见图1-5-5。在右侧的选项卡中选择Acquisition，该选项卡下主要设定文件名称、光谱采集模式、采集时间、采集次数等。采集模式有单窗口模式（Spectro）和谱段模式（Range）两种，单窗口模式中输入谱峰的位置，呈现出来的谱图是以输入的谱峰为中心位置的；谱段模式则是输入谱峰起始位置和终止位置，可以输入多个谱段，最后都会呈现在谱图上，谱段模式的总范围是50～4000cm-1。硅片只在520.7cm-1的位置出现很强的谱峰，因此选择单窗口模式，直接在Spectro后的文本框中输入520.7。采集时间分两种，单次采集时间Acq.time（s）和实时采集时间RTD time（s），其中实时采集只对单窗口模式有效。光栅校准选用实时采集，因此在RTD time（s）文本框中输入1。采集次数Accumulation文本框中输入1；物镜Objective的选择根据实际使用的物镜来选择，此处对应选择“×50LWD”；选择功率衰减Filter，硅片通常选择25%；激光器Laser选用532nm；共焦针孔Hole选择100μm；狭缝Slit选择100μm。光栅Grating，一共有4个，600gr/mm、1200gr/mm、1800gr/mm和2400gr/mm，每一个都要进行校准，先选定600gr/mm。

4.校准　全部参数设定好之后，点击软件上方的三角形按钮，即为实时采集。此时页面上显示硅片的拉曼谱图，实时采集时间为1s，因此每隔1s就会采集一次。在软件左侧一列中选择单线光标，硅峰的理论位置在520.7cm-1，将单线光标移动到520.7。然后在软件右上方选项卡中选择“Maintenance”，然后调节左右按钮移动峰的位置，使得单线位置在峰的中间，即完成了该光栅的校准。点击“Stop”按钮停止实时采集，切换到下一个光栅1200gr/mm。其他参数按照之前设定的不需改变，再点击实时采集，同样的方式校准光栅。再依次校准光栅1800gr/mm和2400gr/mm即可。

（二）样品测试

1.制样　固体样品用双面胶固定在载玻片上；液体样品用样品池或毛细管封装后固定在载玻片上；气体样品建议浓缩后再封装在气体样品池，并固定在样品台上。

2.对焦　双击打开计算机桌面上的软件LabSptc6，选择Viewing模式，此时软件上显示显微镜下的样品图片。固体样品对焦步骤如下：选择10倍的物镜，粗略对焦；切换到50倍场焦，并对焦至图像清晰，在软件右上方点击红色的“Stop”按钮，切换到Raman测试模式。Viewing模式和Raman模式的相互切换在仪器上会有相应指示。液体样品和气体样品在显微镜下难以聚焦，需采用激光聚焦。打开激光器，激光打到样品上，旋转调焦旋钮至样品上的激光光斑最小，此时即为对焦清晰，关闭激光器，切换到Raman测试模式。

3.参数设置　设置过程与硅片校准光栅时参数的设置过程相似，只需稍作改变。例如，样品的测试模式较多选择谱段模式，可以在Range文本框中输入起始和终止位置，并选中后方的正方形图标，显示绿色即表示选中谱段模式。在Acq.time（s）文本框中输入采集时间，采集时间越长，信号越强，但要保证激光不会打坏样品，因此每次测试结束后应返回到Vie-wing模式下观察样品是否受损。采集次数根据实际情况作出改变，次数越多，信号越强，但采集时间相应增加。功率衰减的选择，在未知的情况下从小到大选择，在保证激光不打坏样品的情况下可选择较高功率，信号相应较强。激光器根据需要选择532nm、638nm或785nm；共焦针孔常选择100μm；狭缝常选择100μm；光栅常选择1200gr/mm。这些参数都可根据样品的实际情况作出调整。

4.测试　设定好参数后点击软件上方的圆形按钮，即为单次采集按钮，采集完成后页面上呈现拉曼谱图。一般情况下需要进行多次调试才能确定最佳测试条件，确定好最佳测试条件后点击单次采集，得到的谱图可进行下一步的数据处理和保存。

（三）数据处理

测试得到的样品的拉曼谱图通常需要做一定的处理。这里主要介绍扣背底和标峰位两种常用的谱图处理方式。扣背底包括背底拟合法和手动添加背底线法。

1.扣背底方式

（1）背底拟合法步骤。打开一条测试谱图（图1-5-6），点击软件右侧“Processing”选项卡，选择基线校准Baseline correction。基线校准中需要设定一些参数，背底线类型Type包括Line（线性，适合背底较平的谱图）和Poly（多项式，适合背底是曲线的谱图），根据谱图背底的实际情况选择，多项式较为常用；阶次Degree，可以直接输入阶次数，也可以拖动滑条改变阶次；拟合最大点数Max points，同样可以直接输入点数，也可以拖动滑条改变点数；噪声点数Noise points，当谱线噪声较大时选用较多的噪声点数，运用此项时必须先激活Correct noise，点击该选项前的正方形图标，显示绿色即已激活。点击“Fit”进行拟合，可以尝试选择不同的参数再点击“Fit”，多次重复后找到合适的背底线，图1-5-6中箭头标注的曲线即为拟合的背底线。点击“Sub”扣除背底，获得基线平整的谱图。

（2）手动添加背底线。可以直接选用来获得背底线，也可在背底拟合效果不佳时手动添加背底点来优化背底线。

手动添加背底线步骤：在左侧一列图标工具栏中单击“Add/remove baseline points”图标添加背底线。手动添加背底线时背底线的形状会受到Baseline correction下参数的影响，如果不希望受到这些干扰，可以选择“Line”，并将Degree设为0。在使用手动方法时，一般会勾选“Attach to curve”选项，如果不勾选该选项，则鼠标点击哪里，点就会出现在哪里；而勾选该选项时，添加的点会自动挪到谱线上。如果添加的点不合适，可点击“Remove baseline”清除背底线；如果只想取消其中某个点，可以把鼠标放到该点上，在弹出的窗口中选中“Re-move”移除该点，或选择“Remove all”移除所有点。添加完毕后，点击“Sub”扣除背底。

2.标峰位方式　标峰位包括自动标峰位及手动标峰位，两种方法可任选其一或综合使用。

（1）自动标峰位步骤。打开一条需要标峰位的光谱（图1-5-7），点击软件右侧“Anal-ysis”选项卡，选择标峰Peaks，点击寻找Find，谱图上会出现峰值的标注，改变其中一些参数可以调节所需要标注的峰值。Ampl（%）：强度阈值，在文本框中输入数值0～100，则小于最大强度的（0～100）%的峰将不会被标出。Size（pix）：间隔阈值，若文本框中输入数值10，则当两个峰之间的间隔小于10个像素时，该峰将不会被标出。这两个参数均可直接在文本框里输入数值，也可拖动滑条改变强度阈值和间隔阈值，调整所要标的峰位，完成标峰。图1-5-7中箭头标注的曲线是标峰拟合后的曲线。

（2）手动标峰。手动标峰可直接使用来标记某些特定的峰，也可以在自动标峰位无法获得一些需要标记的峰位时，通过手动方法来实现。

手动标峰位步骤：在左侧一列图标工具栏中单击“Add/remove/edit peaks”图标，将鼠标移到需要标记的峰位上，点击鼠标左键添加峰位。若点击的地方不是很准确，可通过微调来移动峰位，方法是将鼠标移到待修改峰位的标记上停留，使鼠标变成十字，然后移动鼠标使峰位标记在正确的位置。如果想要去除某个标记的峰位，则将鼠标移到该标记上，点击右键，选择“Remove”即可；如果要取消所有标记，则选择“Remove All”。

（四）数据保存

处理完的谱图保存，可以点击软件上方的保存按钮，其中有两种保存方式。一种是Save to group file，就是将所有测试的谱图都打包保存到一个文件中；另外一种是单个谱图保存，在右侧选中一个谱图点击保存即可。保存的格式选择.txt，后期可用其他画图软件画出谱图。

五、实例分析

选择某一由未知纤维组成的织物为测试对象。

将织物剪至合适的尺寸并用双面胶固定在载玻片上，放置于载物台上。物镜放大倍数先选择10倍进行粗略对焦，再选择50倍的场焦进行精确对焦，选择合适的测试点。

测量范围先选定500～2500cm-1，在调试阶段测量范围不宜选择过宽，否则谱图无法一次呈现在CCD上，需要2次才能完整呈现谱图，会导致测试时间加倍。可在确定好采集时间、采集次数、激光功率、光栅刻线数、共焦针孔、狭缝等参数后再增加测量范围。输入采集时间1s，采集次数1次，激光功率选择1%，光栅刻线数选择1200gr/mm，共焦针孔100μm，狭缝100μm，点击单次检测。

根据谱图情况调整各参数以确定最佳测试参数。最后测试条件确定为：测量范围200～2200cm-1（2200cm-1之后的谱段未出现明显特征峰）、采集时间2s、采集次数20次（采集次数多，最后得到的20次叠加的谱图效果更好）、激光功率25%、光栅刻线数1200gr/mm、共焦针孔100μm、狭缝100μm。点击单次采集，得到最终的拉曼谱图。

数据处理与保存：选择测试得到的拉曼谱图，点击软件右侧Processing（处理）选项卡，选择基线校准Baseline correction，背底线类型选择Poly（多项式），阶次Degree输入2，点击Fit进行拟合，适当增减拟合点数以得到较好的谱图质量，然后点击Sub扣除背底，获得基线平整的谱图，将谱图保存为txt格式的文件。

重新绘制拉曼谱图：将保存好的txt文件打开，复制数据到软件Origin 75中，重新绘制谱图，并标注特征峰位置。

测得的织物的拉曼光谱图如图1-5-8所示。从谱图上可以看出，该织物在1617cm-1有很强的谱峰，该处主要是苯环的振动峰（1610cm-1附近），由此可以判断出组成织物的纤维中含有苯环。在常规的化学纤维中，聚酯纤维含有苯环。此外，该织物在1290cm-1和1731cm-1处也存在明显的特征峰。酯基中C=O双键的伸缩振动在1680～1780cm-1处，与羰基相连的C—O键的伸缩振动峰，脂肪族出现在1160～1240cm-1处，芳香族出现在1270～1290cm-1处，由此可以判断，该织物在1731cm-1处的峰是酯基中C=O双键的伸缩振动峰，在1290cm-1处的峰是芳香族物质中与羰基相连的C—O键的伸缩振动峰。由此基本可以判断该织物中所含的化学纤维是聚酯纤维。聚酯纤维中还存在C—C键，C—C键的伸缩振动峰主要出现在1040～1160cm-1处。从拉曼谱图中也可以看到在1096cm-1处有特征峰。综上所述，可以判断组成该织物的纤维是聚酯纤维。

对于单一种类的纤维或由单一纤维组成的织物，通过拉曼光谱可以比较快速和准确地判断出来，但对于混合纤维或混纺织物，则需要借助显微镜观察法、燃烧法、染色法、拉曼光谱法等多种手段进行判别。