第二章 病原与免疫学
第一节 病 原 学
一、 形态与生理学特征
(一) 基本形态与染色性
肺炎支原体具有支原体属的共同特征如:①高度多形性;②可通过0.45μm或0.22μm微孔滤膜;③缺乏细胞壁,在固体培养基上有形成油煎蛋菌落的倾向;④基因组较小,富含A-T。在电镜下观察肺炎支原体,其基本形态为球形、双球形及丝状。有时呈杆状、环形、哑铃状、念珠状等不规则形态。球形肺炎支原体大小为50~700nm,丝状大小为(100~400) nm ×(50~100)μm。在液体培养基中,MP可进行滑行运动,在固体培养基表层生长,呈细颗粒状,无尾部。肺炎支原体初次分离株不出现透明边缘区,呈圆形、圆屋顶状或颗粒状,反复传代可成“油煎蛋状”(图2-1)。
图2-1 肺炎支原体菌落
A.原代菌落;B.传代“油煎蛋”菌落
由于MP无细胞壁,因此Gram染色为阴性,但不易着色;Giemsa染色时间约需15分钟,呈淡紫色;菌落用Dienes染色成蓝色,不易褪色,而细菌(除嗜血杆菌外)一般不易着色,可达到鉴别MP的作用。
(二) 超微结构特征
肺炎支原体的超微结构简单,无细胞壁,菌体最外层为细胞膜,由蛋白质与脂质组成“三明治”结构,即内、外二层主要是蛋白质,中间层为脂质。细胞膜中胆固醇含量较多,约占36%,对保持细胞膜的完整性具有一定作用。胞质内含核糖体颗粒、双链DNA及质粒或转座子。电子显微镜下观察,可见肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构(terminal structure)(图2-2),能使支原体黏附于呼吸道黏膜上皮细胞表面,与其在黏膜上的定植和致病有关。另有报道,MP细胞膜外具有荚膜样物质,但尚无定论。
图2-2 扫描电镜观察肺炎支原体呈短细丝状,可见细胞尖端结构
(三) 生长与培养特性
肺炎支原体生长比一般支原体慢,1~6小时分裂一代。因此,标本接种后一周内基本很少能看到菌落形成,有时需要3周才形成肉眼可见的菌落形态。 但反复传代后生长加快,对数生长期细胞数可达10 7CFU/ml。液体培养物在相差显微镜下为球形或长丝状,以滑行方式运动,液体不易混浊,有时可见丝状或小球颗粒黏附于容器表面;在固体琼脂培养基上孵育的典型菌落呈荷包蛋样,但又区别于一般支原体,呈圆形、中间隆起、有颗粒,如杨梅状,直径20~500μm;半固体培养基中呈现细小菌落,肉眼可见。
MP基因组小,生活合成能力有限,在自然界不能自由生存,需由其寄生的宿主提供多种营养物质才能繁殖。支原体的营养要求比一般细菌高,其生长需要胆固醇。常用的培养基是以牛心消化液为基础的,加入10%~20%人或动物血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。MP在有氧条件下也能生长,在含5%CO 2中生长最好,最适pH为7.5~8.0,低于7.0则死亡。
(四) 生化反应与抵抗力
MP菌落能吸附豚鼠红细胞、产生溶血素,能迅速而完全地溶解哺乳动物红细胞。MP生长时能分解葡萄糖产酸,使培养基出现酸性颜色变化,pH下降,故在MP培养基中加入葡萄糖及酚红作为指示剂来观察其生长情况。MP不能利用精氨酸和尿素,可还原亚甲蓝,还原无色的氯化三苯基四氮唑(TTC)成粉红色化合物。上述生化反应特点都可用于肺炎支原体的鉴定指标。
由于缺乏细胞壁,MP对理化因素的抵抗力较细菌弱,对干燥剂敏感。对常用消毒剂敏感,对醋酸铊、亚甲蓝和青霉素的抵抗力较细菌强。因此,在分离培养时,加入此类药物可防止杂菌的生长。对干扰蛋白质合成及作用于胆固醇的抗菌药敏感,对干扰细胞壁合成的抗生素耐药。耐冷,-70℃或液氮可长期保存菌株,在4℃则保存时间不宜超过3天。
二、 基因组特征
自1995年10月,人类完成了第一个支原体,即生殖支原体G37株的基因组测序,目前已完成17株支原体基因组测序,包括肺炎支原体。
肺炎支原体M129基因组全长816 394bp,G+C含量40%,双链丰余度为2.95。预测含有688个开放阅读框(open reading frame,ORF),42个RNA编码基因,发现1个具有200个寡核苷酸的RNA。75.9%的ORF与其他细菌(主要是生殖支原体)基因组具有同源性。在所有ORF中,已明确458个编码功能蛋白。42个特征性功能域,包括亮氨酸拉链序列、典型原核细胞脂蛋白序列和ATP/GTP的结合位点。用结构域分析程序对蛋白质结构进行分析,发现275个属于跨膜蛋白,29个具有高度螺旋结构,提示膜蛋白占50%以上。大约8%的基因组具有重复片段,这些重复DNA片段主要为RepMP2/3、RepMP4和RepMP5。
肺炎支原体基因组具有偏嗜性,AUU(Ile,4.6%)、AAA (Lys,4.6%)、UUU(Phe,4.3%)、GAA(Glu,4.2%)和UUA(Leu,3.9%)是最常使用的密码子,而UGC(Cys,0.2%)、CGA(Arg,0.29%)、AGG(Arg,0.4%)和UGU(Cys,0.55%)是最少使用的密码子。蛋白质中含量较丰富的氨基酸是Leu(10.3%)、Lys (8.5%)、He(6.6%)和Val(6.5%)。G+C比例高的区域通常编码P1基因、P1操纵子元件的ORF6、重复DNA序列或tRNA,G+C含量少的区段主要编码一些脂蛋白或HSD修饰/限制系统。
肺炎支原体基因组中参与DNA修复和复制的DNA聚合酶Ⅲ只存在τ、γ、δ′、β四个亚单位。由于肺炎支原体不编码polA样的DNA修复酶,同时缺乏作用于引物转位的RNaseH和作用于复制终止的蛋白。所以,肺炎支原体的突变率比其他支原体高。通过同源性比较发现,肺炎支原体仅有一个信号因子(sigaA)参与表达和调控,提示肺炎支原体没有类似双信号系统,对外界刺激的应答不依赖于σ因子的表达水平。同时,肺炎支原体还具有多种GTP-结合蛋白和一种毒力相关蛋白vacB,也可能参与基因表达与调控。
肺炎支原体的翻译机制相对完整,约有15% ORF编码的蛋白质参与其中,包括19种tRNA合成酶、50种核糖体蛋白、33种tRNA、1个rRNA操纵元件(编码5S、16S和23SrRNA)和1个10SRNA。这种10SRNA在进化上十分保守,经翻译后可能起tRNA和mRNA的作用。
在肺炎支原体中发现了三种转运系统:①磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS);②ABC转运系统:由2个ATP结合区、2个跨膜区和1个底物结合区组成;③主动扩散系统:该系统利用跨膜蛋白作为特异性转运载体。