随着人们对H-FABP了解的深入，H-FABP的临床检测方法也迅速发展起来。H-FABP是一种无酶活性的蛋白质，其检测与定量需要借助免疫学方法。从最早期的放免法到最近出现的乳胶微粒增强免疫比浊法以及胶体金免疫技术在H-FABP测定中的应用，H-FABP的临床检测经历了一个检测速度越来越快，检测灵敏度也越来越高的发展过程。

最早被报道用于FABP定量检测的方法是Ockner RK等于1974年在研究小肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）时采用的放免法，他们用 ¹⁴C标记抗血清与待测标本反应，通过测定免疫沉淀中放射性比活度来检测相应I-FABP的浓度。随后，Ockner RK等于1982年又利用相同的方法完成了对肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）的定量检测。鉴于H-FABP与I-FABP和L-FABP相似的分子大小以及不同的抗原决定簇，此法应同样适用于H-FABP的定量检测。然而，放免法准备及测定过程都较为繁琐，所需的放射性同位素价格昂贵且存在放射性污染，因此在临床检测中缺乏实用价值。但是，作为最早报道的FABP的定量测定方法，放免法为以后的方法改进奠定了基础。

随着H-FABP单克隆抗体的制备成功，ELISA法逐渐成为检测H-FABP的主流方法。由于H-FABP分子量较小，竞争性ELISA法最先进入人们的考虑范围并于1989年被Knowlton AA等研制成功。实验采取鼠抗兔H-FABP单克隆抗体作为捕获抗体，用定量的过氧化物酶（HRP）标记的标准抗原与标本中的抗原竞争性结合捕获抗体，最后通过底物显色反应达到标本中抗原定量的目的。虽然检测时间高达16小时，但是竞争性ELISA法定量H-FABP血浆浓度的成功证明了基于单克隆抗体的ELISA方法用于H-FABP定量的可行性，为以后ELISA方法的改进积累了经验。

Yasuhiko Ohkaru等于1995年报道了他们研制成功的双抗体夹心ELISA法定量H-FABP浓度的试剂盒。他们采用8E3抗人H-FABP抗体作为捕获抗体，HRP标记的8B9抗人H-FABP抗体作为标记抗体。试验通过标本抗原与捕获抗体结合、抗原-捕获抗体复合物与标记抗体结合、底物的加入与显色以及测量620nm波长的吸光度四个步骤完成。检测时间缩短至75分钟；最低检测浓度为1.25ng/ml，血浆标本的检测线性范围达到0～220ng/mL；组内与组间不精密度分别为7.9%和7%。上述技术参数显示该试剂盒表现比较令人满意。

随后，Wodzig KW等于1997年研制成功了一种一步法双抗体夹心ELISA用于血浆H-FABP浓度的定量。这种技术基于一种高亲和力单克隆抗体的构建成功。它与上述两步法的不同之处在于：将待测抗原与酶标抗体一次性加入捕获抗休包被的固相载体表面。一步法双抗体夹心ELISA使得血浆H-FABP定量的检测时间缩短到45min，最低检测浓度可达到0.2ng/ml，组内与组间不精密度分别低于6%和11%，但是检测的线性范围很窄，只有0～6ng/ml。

2000年Farooq G等介绍了一种全自动的双抗体夹心ELISA法，该技术利用全自动酶标仪以及微量进样系统使得ELISA的操作得以自动化，非常适合临床大批量标本的检测。该检测方法组间不精密度分布于2.3%～7.0%，相比手工法有了进一步的改进。

总之，双抗体夹心ELISA试剂盒的研制成功标志着实验室定量检测H-FABP技术的成熟。该方法的线性范围，不精密度等指标均比较理想，但是已经报道的ELISA检测方法的检测时间最快也只有45分钟，对于出现于AMI早期的心肌标志物来讲，这无疑限制了这种检测方法的应用。

Robers M等于1999年介绍了一种可用于H-FABP定量的基于原位沉淀加强椭圆滤计比浊的ELISA法，该ELISA法与上述标准ELISA法不同之处在于使用了致沉淀底物二氨基联苯胺（DAB）而非经典使用的显色底物四甲基联苯胺（TMB）作为HRP的底物。最后通过椭圆滤计比浊法测定固相载体表面的浊度增加情况，并据此计算出标本中H-FABP的浓度（如图3-5-3所示）。由于DAB经HRP作用后的沉淀产物多集中在抗原抗体结合物原位的固相载体表面，所以浊度的增加主要体现在固相载体表面这一二维的结构中：而经典的TMB底物产生的颜色变化则分布在反应孔这个三维的结构中。相比之下浊度的增加更为敏感，所以依据这个原理建立的ELISA法有着比以往ELISA法更强的灵敏度与更快的反应时间：H-FABP的检测最低浓度可达到100fmol/L，相当于1.25×10 ^-4ng/mL；而检测时间也相应缩短至10～20分钟。但是其检测浓度的线形范围相对较窄，只有0～10ng/mL，对于浓度较高的心梗患者的标本，只能通过稀释进入检测的线性范围。

免疫传感器技术将免疫学方法的特异性与传感器方法的敏感性结合在一起，可用于非酶类蛋白质的检测。1996年，Siegmann-Thoss C等成功地设计出了第一种利用免疫传感器检测H-FABP浓度的方法。该免疫传感器采用Clark型氧电极，采用固定于硝酸纤维素膜上抗H-FABP抗体为捕获抗体，葡萄糖氧化酶（GOD）标记的另一抗H-FABP抗体为标记抗体，标记好抗体的免疫膜被包被于氧电极上，加入待测抗原和底物葡萄糖后通过氧电极检测出的GOD含量换算出待测抗原的浓度。基于这种免疫传感器的检测方法检测时间需要30min，检测下限为5ng/ml，线性范围0～50ng/ml。但是，固定了捕获抗体的免疫膜只能检测10次就需要更新并重新包被于电极表面，这需要耗费大量的人力物力，不适用于临床标本的检测。

Schreiber A等于1997年研制成功一种基于可抛弃电极的免疫传感器系统用于血浆标本H-FABP浓度的定量。这种传感器系统采用Ag/AgCl参照电极，捕获抗体被事先通过吸附作用固定在电极表面，用双抗体夹心模式捕获待测抗原并通过碱性磷酸酶标记的第二抗体完成免疫反应。加入含有氨苯基磷酸的底物液后，碱性磷酸酶可以催化氨苯基磷酸生成氨基苯酚，后者在电极表面被氧化并释放电子进而被Ag/AgCl参照电极检测到，据此抗原浓度得以定量。这种检测方法的检测时间小于20min，检测下限为10ng/ml，而线性检测范围可达0～350ng/ml，组内和组间不精密度分布于10%～15%和9%～16%。由于本免疫传感器用到的捕获抗体标记电极是可抛弃型的，且在低温下（4℃）比较稳定，抗体活性可保持三个月，所以在检测前可以批量生产，这在一定程度下避免了Siegmann-Thoss C等方法的不足。

乳胶微粒增强的免疫比浊法常用于含量微小的蛋白质检测，1998年，Robers M等成功将其引入到H-FABP的检测中。试验设计采用三种针对不同表位的抗H-FABP单克隆抗体标记乳胶微粒，抗体与相应抗原结合后导致乳胶微粒的凝聚，根据浊度增加的情况计算H-FABP的浓度。检测所需试剂与样本量极少，只需要75μl乳胶结合抗体、155μl反应稀释液以及25μl的血浆标本，检测时间在10分钟之内，检测的最低浓度可达1.1ng/ml，线性范围分布于0～150ng/ml。整个分析过程可以在临床全自动免疫比浊分析仪上进行，自动化程度高，适用于临床大量标本的处理。

胶体金免疫技术是利用胶体金聚集显色的特性将其与特异的单克隆抗体标记，从而检测特异抗原的技术。Toshio Watanabe等于2001年研制成功了一种以全血标本作为检测对象的H-FABP定性试纸条。试纸条由以下三个区域构成：样品接收区域，由固相血浆分离介质组成；反应区域，由包含有胶体金标记的显色抗体的结合板构成；检测区域，由标记有两种捕获抗体的尼龙膜以及吸水能力强的纤维素膜构成（如图3-5-4）。试纸条的一大特点是设计了一个所谓的固相血浆分离介质用以分离抗凝全血标本中的血浆，这一设计使得临床省去了样本离心的步骤，间接缩短了检测时间。实验显示这种基于免疫胶体金技术的试纸条对全血标本的定性时间在15分钟以内，操作也很方便，唯一不足之处在于不能定量，限制了H-FABP在估计心肌梗死面积以及动态观察进行性心梗方面的应用。

2003年Chan CPY等利用一种特殊的读卡器对阳性结果检测线扫描得出胶体金聚集颜色的密度，据此计算出待测抗原的浓度，从而达到对H-FABP浓度的定量。免疫胶体金试纸条的设计与上述Toshio Watanabe等的方法类似，不同之处在于检测样本采用血浆标本。实验结果显示：检测时间仅需15分钟，检测下限2.8ng/ml，检测的线性范围达到0～125ng/ml，组内与组间的不精密度分别为8%～10%和10%～15%。这种试纸条比较稳定，常温或4℃可存放达一年之久而没有抗体活性的明显降低。这种检测方法在一定程度上解决了免疫胶体金技术不能定量的问题，但是定量的检测下限仍不能和传统ELISA方法相比。

国外较常应用的有Rapicheck和CardioDetect两种定性检测试剂盒，10～15分钟内得到结果。Lateral-flow是一种准确度更高的定量检测方法，2003年用于临床，15分钟得到结果。以上检验方法简易快捷，节约时间和费用，不需要特殊检测设备，值得临床推广。

国外在研究H-FABP正常参考值方面已经做了不少工作，国内有使用国外试剂盒检测H-FABP的报道，但其H-FABP各正常参考值报道不一，国内外一些涉及ELISA方法的正常参考值的结果见表3-5-1。

正常参考值的差异较大，原因可能是不同国家、人种H-FABP基础水平值存在的个体差异；抗原抗体特异性的不同，其特异性、敏感性也可能不同。

H-FABP大量地存在于心肌组织中，约占心脏全部可溶性蛋白质的4%～8%，正常人心肌中约含H-FABP（0.52±0.06）mg/g湿重，主要存在于心室中，心房含量较少。为心肌所含Mb 的1/5；骨骼肌仅含0.14mg；肾脏含量约为心脏的1/20。H-FABP在正常的血浆和尿中不含或极少量的存在，血浆参照浓度为（2.1±1.1）μg/L ^-1（约为Mb的1/16），上限为5μg/L ^-1，在血液循环中快速的清除，当心肌缺血时，心肌细胞动员脂肪酸供能，致H-FABP大量增加，因其分子量小，可从心肌细胞中迅速释放入血并从尿中排出，因此，若血清中H-FABP出现明显增高，即可以准确的判断有心肌损伤，因其主要通过肾小球滤过，故常在12～24小时血H-FABP浓度回到正常范围，具有“速升”和“速降”的特点。H-FABP诊断心肌损伤具有很好的特异性。诊断AMI的血浆参考浓度为10～350μg/L，血浆浓度在AMI发病后1.3～3小时开始升高，12～24小时恢复正常，8小时左右达到峰值。胸痛和不稳定性心绞痛（UAP）组患者血浆H-FABP浓度则为11～15μg/L。