二、临床检测方法及参考值

(一)检测方法

Bar-Or等于1990年首次发现了这种白蛋白,并于1992年建立了白蛋白-钴结合(albumin cobalt binding,ACB)实验,目前IMA测定都是采用白蛋白-钴结合试验。Bar- Or等首先建立了一个手工分光光度法,简单、方便,适合于所有基层单位使用和大规模的流行病学调查。随后局部缺血技术公司(Ischemia Technologies,Den-vor Colorado)开发了试剂盒,于1999年建立了全自动生化仪测定IMA的方法。2001年白蛋白-钴结合试验通过ISO9001、ISO13485、EH46001认可,并首先在欧洲销售;2003年2月美国食品与药品监督管理局(FDA)批准可上市销售。2005年,美国率先将IMA于辅助诊断临床急性冠脉综合征。由于此项新技术涉及专利权问题,美国文献介绍的IMA测量试剂对中国实行技术封闭,为尽早将这一极具诊断价值的项目用于我国急性心肌缺血患者早期诊断,使我国心肌梗死患者受益,北京航天总医院检验科2004年开始研究IMA测量方法,经过不懈努力与数次实验,成功建立起IMA的测量方法,准确测量血清IMA的浓度。由于该项目属国内领先,2010年被授予国家科技发明专利。
血清标本中的正常白蛋白以活性形式存在,加入氯化钴溶液后,Co 2+即可与白蛋白N-末端结合,溶液中存在的游离Co 2+浓度较低,而心肌缺血个体的血清标本中含有较多修饰后的白蛋白,加入同样浓度的氯化钴溶液后,由于IMA与Co 2+结合的能力减弱,溶液中存在较高浓度的游离钴,加入二硫苏糖醇(1,4-Dithiothreitol,DTT)溶液可与游离钴发生颜色反应,显色越强,表明未结合Co 2+越多,而Alb-Co 2+结合力与反应显色强度呈负相关。以分光光度法测定其吸光度,即可推测IMA含量,以吸光度单位报告结果。此法即可手工操作,也可在全自动生化仪上完成。

(二)生化自动分析仪测定法

IMA采用白蛋白-钴离子结合实验,目前国内医院主要使用的日立7600全自动生化分析仪,日本OLYMPUS AU-2700,强生公司Vitros 5.1 FS化学分析仪,贝克曼AU-2700型全自动生化分析仪等。IMA测定试剂盒:国内生产商主要有长沙颐康科技开发有限公司,北京华宇亿康生物工程技术有限公司等厂家。值得注意的是,由于没有标准品,各家使用的仪器也不相同,特别所选的测定波长也不相同,导致结果有一定差别。因此各实验室在使用此方法时,应结合本实验室的具体情况,确定判断阈值。
样本需要预处理:血清或肝素化的血浆500ul,加0.45gCaCl 2粉末,充分摇匀,在1000~1200g离心10分钟,离心后取300ul上清液转移到COBAS MIRA或FARA样品杯中。进行这个预处理操作,目的是除去用作防腐剂的螯合剂,它可能存在于接受静脉内药物治疗患者的样本中。取经处理的患者样本95ul,加11.6mmol/L钴溶液5ul(最终浓度0.58mmol/L皿内保温5分钟,保温结束后加8.35mmol/L DTT试剂25ul(最终浓度1.67mmol/L),在500nm测定吸光度。用5个校正物制备校正曲线,校正物定值为6~186单位/ml,正曲线查得ACB试验结果。本法宜用血清标本进行测定,不宜使用任何抗凝剂和防腐剂,亦不宜用促凝管和凝聚胶。标本在室温下充分凝集后,离心分离血清,确保血清中无血红蛋白、红细胞、纤维蛋白凝块和其他微粒。血液标本采集后应在2h内完成测定,如果做不到,应在1小时离血清,-20℃或更低温度下保存。测定之前将冷冻标本在室温下融化,彻底混匀,Sinha认为这种方法处理的标本,其试验结果与新鲜标本无显著差异。

(三)优点

除上述方法还有液相色谱法、质谱测定法以及磁共振等,但因检测成本较高,不适合临床常规检测。Bar-Or等研究发现IMA在pH>7.0时金属钴与人类血清白蛋白(HSA)的N-末端结合力最强,使用高压液相色谱/正电子散射离子化质谱(HPLC/MS)法检测IMA,通过调节pH、改变游离半胱氨酸/胱氨酸的比例等措施,可能提高IMA诊断的特异性,扩大临床应用范围。