组蛋白乙酰化和甲基化的研究方法在很大程度上是互通的，因此，本节将论述同适用于两者研究的方法以及特异用于乙酰化研究的方法。

研究组蛋白PTM的传统方法有Edman降解法和免疫测序法。Edman降解法在早期鉴定组蛋白修饰中发挥了重要的作用，但其最大的缺陷是需要大量的高纯度样品，这一过程需要耗费大量的时间，并且对那些N端封闭的序列无能为力。目前，所有已知的组蛋白修饰位点的抗体都可以购得，以抗体为基础的免疫测序分析技术，如Western blot、免疫共沉淀、Pulldown等已广泛应用于组蛋白修饰的研究。但Western blot只能从细胞以及组织的整体水平上进行甲基化/乙酰化组蛋白表达水平的检测，远远不能满足更深一层次研究需求。因此，为了分析基因组上特定位点所发生的组蛋白甲基化/乙酰化，以及在组蛋白PTM过程中对它的变化进行定量检测，多采用在细胞和组织来源的非变性染色质上进行染色质免疫沉淀（ChIP）来分析。对于沉淀下来的染色质组分中DNA的分析方法有多种，如果所研究的修饰组蛋白的靶序列是已知的，或者怀疑某个序列发生了问题，则此组蛋白的靶序列DNA可以采用Southern blot和聚合酶链反应（PCR）分析。Southern blot方法准确度较高，但操作复杂。PCR方法中，琼脂糖定量法简单方便，但准确性低。位素PCR法准确性虽有提高，但操作不便。Real-time PCR法虽可做到实时定量，准确性高，但价格昂贵。如果组蛋白的靶序列未知，或者欲研究此组蛋白在基因组上的分布情况，找出反式作用因子的结合位点，可采用ChIP与芯片结合技术。质谱分析技术在组蛋白修饰的研究中也发挥重要作用。蛋白质的乙酰化是可逆的，组蛋白的乙酰化与去乙酰化对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用，因此在组蛋白乙酰化的相关研究中，还包括针对去乙酰化的研究方法。

ChIP是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术可判断在细胞核基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

通过对含有标记的待测染色质片段进行免疫沉淀来确定富含特定PTM的基因组位点，然后再对与该PTM相关的不同位点所占的相对比例进行定量。简言之，其研究过程为，通过处理染色质产生短的染色质片段，然后用针对组蛋白特定修饰的抗体进行免疫沉淀。制备染色质片段一般有两种方法，一种是使用标准微球菌核酸酶（MNase）消化细胞核成单核小体，称为非变性染色质免疫沉淀（nChIP），可在不改变修饰的同时让蛋白质恢复原状，用于研究同DNA有高亲和力的蛋白，如组蛋白及其修饰后的同工体；另一种是通过在细胞中加入甲醛或者将细胞暴露在紫外线使得染色质发生交联，将染色质结合蛋白的位置“冻结”，接着用超声波将染色质切割成小片段（酵母细胞必须先通过机械力剪切或酶消化进行细胞壁破碎），此法称为xChIP，用于研究同DNA结合亲和力不高的蛋白质，如绝大多数非组蛋白。此处仅介绍对研究组蛋白乙酰化/甲基化最为合适的nChIP。nChIP的主要原理是：从新鲜和（或）冰冻组织或细胞中纯化细胞核，使用MNase切割纯化后的细胞核来对染色质进行分离，此酶可优先切开核小体之间的连接子DNA，继而将识别感兴趣的组蛋白修饰的抗血清与片段化的染色质共同培育，然后将未结合组分同抗体-结合组分分离开。nChIP的优点在于：①可达到单核小体水平上的高分辨率；②免疫沉淀所得的蛋白质复合物可直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，有助于把握免疫沉淀的效率；③在nChIP准备阶段丢失的蛋白质可能会对分析附着有转录因子的修饰后核小体有帮助，而在xChIP中这些蛋白质一并被沉淀下来。

如果目标基因或启动子中假定的组蛋白修饰位点是已知的，想分析该位点的PTM水平，可以通过实时定量PCR或在溴乙非啶染的凝胶上对PCR产物进行定量来实现。简而言之，从免疫沉淀产物和投入组分的稀释液中将待分析位点扩增出来，并进行比较，最好是针对于组蛋白免疫沉淀平行样中带有PTM的这些组分，那么PCR就可以对组蛋白某个位点的特定修饰进行定量。如果为了确定特定组蛋白修饰在一个特定位点上是否有富集，可进行双重扩增，将来自于所感兴趣区域的片段和一个对照片段进行同时扩增，标准化的PTM/组蛋白比例同附近经预测没有相应PTM区域的比例进行比较。这种方法可以用来确定通用启动子区域内的组蛋白修饰位点，以及组蛋白某个位点的修饰动力学。比如，要对比一种处理后小鼠组蛋白某位点与正常小鼠相同位点的乙酰化水平，使用针对组蛋白该位点乙酰化的抗血清进行ChIP，设计两套PCR引物，一套对应于待检测基因，另一套对应于对照蛋白基因。对抗体-结合组分和对照进行双重扩增之后，在电泳胶上比较检测基因特定PCR产物和对照蛋白产物之间的强度，将所算出的比率与正常小鼠的数据进行对比，可发现组蛋白该位点乙酰化水平的变化。此外，在剂量-补偿机制的等位基因或者哺乳动物基因组印记研究中，可使用单链构象多态性方法（SSCP），将活化等位基因扩增产物同代表沉默等位基因的PCR产物区别开来。比如，用SSCP分析组蛋白甲基化的等位基因特异性模式。提取父系基因组和母系基因组动物杂交的动物样本，在制备了细胞核及非变性染色质后，用针对组蛋白不同位点（双）甲基化的多克隆抗血清进行ChIP。对于结合和非结合组分进行放射性PCR，所使用的一套引物是用于扩增印记-控制中心的唯一序列的。PCR产物变性后，进行非变性聚丙烯酰胺电泳，对结合和非结合组分进行分析，了解父系和母系等位基因的情况（图4-5）。

①主要材料：0.05%（ W/ V）胰蛋白酶溶液；缓冲液Ⅰ：含0.3mol/L蔗糖、60mmol/L KCl、15mmol/L NaCl、5mmol/L MgCl ₂、0.1mmol/L EGTA、15mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.5mmol/L DTT、0.1mmol/L PMSF及3.6ng/ml抑肽酶；缓冲液Ⅱ：含0.6mol/L蔗糖、60mmol/L KCl、15mmol/L NaCl、5mmol/L MgCl ₂、0.1mmol/L EGTA、15mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.5mmol/L DTT、0.1mmol/L PMSF、3.6ng/ml 抑肽酶、0.4%（ V/ V）IGEPAL CA-630 ^R；缓冲液Ⅲ：含1.2mol/L蔗糖、60mmol/L KCl、15mol/L NaCl、5mmol/L MgCl ₂、0.1mmol/L EGTA、15mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.5mmol/L DTT、0.1mmol/L PMSF及3.6ng/ml 抑肽酶。②从组织中纯化细胞核：切割组织，总量不超过0.2g，用PBS冲洗；在预冷的玻璃匀浆器中用5～10ml冰预冷的缓冲液Ⅰ匀浆组织，预先用2ml缓冲液Ⅰ湿润4层纱布，然后用其来过滤细胞悬液；将细胞悬液转移到聚丙烯管中，4℃ 6000×g离心10分钟，弃去上清，用2ml预冷缓冲液Ⅰ重悬细胞，加入2ml预冷缓冲液Ⅱ；准备2根各含有8ml预冷缓冲液Ⅲ的14ml管子，在8ml蔗糖上加上2ml细胞悬液，用封口膜封闭管口；4℃ 10 000×g离心20分钟，细胞核沉在管底呈颗粒状，细胞质在顶层，吸去上清。注意顶层溶液不能与细胞核颗粒接触；用1ml MNase消化缓冲液重悬细胞核颗粒，放置冰上。③从培养细胞中制备细胞核：5×10 ⁷～5×10 ⁸个细胞，细胞融合率不超过50%；用PBS洗涤细胞，胰酶溶液消化（对于贴壁细胞），在2个14ml试管中平分细胞悬液，4℃ 4000×g 离心5分钟。余步骤同上。

①主要材料：MNase消化缓冲液：0.32mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、4mmol/L MgCl ₂、1mmol/L CaCl ₂、0.1mmol/L PMSF；MNase在50%（ V/ V）甘油中配成10U/ml溶液，10～20μl等分后冰冻，每份MNase在融化后只能使用一次，确保在不同的染色质制备中酶活力是相等的；终止溶液：20mmol/L EDTA（pH8.0）；透析管，厚度0.5mm；透析管处理液Ⅰ：2%（ W/ V）碳酸氢钠、1mmol/L EDTA（pH8.0）；透析管处理液Ⅱ：1mmol/L EDTA（pH8.0）；透析缓冲液：1mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、0.2mmol/L EDTA、0.2mmol/L PMSF。②MNase分离：1ml预冷的MNase消化缓冲液重悬细胞核，放置于冰上；在2个1.5ml EP管中分别加入500μl重悬细胞核，再加入1μl MNase，轻柔混合；将两个EP管放入37℃水浴中，各自温浴6分钟和9分钟，加入20μl终止溶液，在冰上冷却。③透析管准备：透析管截为10～20cm长，用0.5L透析管处理液Ⅰ煮沸10分钟；蒸馏水冲洗2遍；0.5L透析管处理液Ⅱ煮沸10分钟；冷却后，将透析管完全浸没保存在4℃的透析管处理液Ⅱ中；使用前用蒸馏水冲洗。④可溶性染色质组分的获取：将MNase分离后细胞核装在1.5ml EP管内，4℃10 000× g离心10分钟；将上清转移到另一管内，4℃保存，其内含有第一份染色质可溶性组分S1，只含小片段；用500μl透析缓冲液重悬颗粒，将之转移到透析管中，用夹子封闭透析管；将透析管浸入透析缓冲液中12～16小时，置于4℃，保持温和搅拌；透析完后将细胞核转移到1.5ml EP管中，4℃ 11 000× g离心10分钟；将上清转移到新的EP管中，4℃保存，此为可溶性染色质第二组分S2，其内含透析过程中从细胞核得到的染色质较大片段；用50μl裂解缓冲液重悬沉淀颗粒，4℃保存，此为染色质颗粒组分P。

①主要材料：6×上样缓冲液：30%（ V/ V）甘油水溶液、0.25%（ W/ V）溴酚蓝、0.25%（ W/ V）二甲苯青（4℃保存）；20%（ W/ V）SDS；1×TBE电泳缓冲液：0.09mol/L Trisborate、2mmol/L EDTA（pH 8.0）；100bp DNA ladder；ChIP培养缓冲液：含50mmol/L NaCl、0.1mmol/L PMSF和5mmol/L EDTA的Tris-HCl（pH 7.5）；针对特定赖氨酸/精氨酸残基单、双、三甲基化/乙酰化组蛋白多肽的纯化抗血清。一般在ChIP中使用5～10μg抗体对应20μg基因组DNA；A蛋白或G蛋白（根据免疫沉淀中抗体特点挑选使用）：A蛋白和G蛋白是细菌细胞壁蛋白质，能结合抗体的Fc段，在中性或微偏碱性条件下结合能力最强，可与琼脂糖共价结合。对于兔源多克隆抗血清以及IgG2a、b和IgG3亚类小鼠单克隆抗体，A蛋白最适合。对于小鼠IgG1单克隆抗体和小鼠、大鼠、绵羊和山羊多克隆抗血清，G蛋白比较合适；洗涤缓冲液A：50mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、10mmol/L EDTA、75mmol/L NaCl（4℃保存）；洗涤缓冲液B：50mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、10mmol/L EDTA、125mmol/L NaCl（4℃保存）；洗涤缓冲液C：50mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、10mmol/L EDTA、175mmol/L NaCl（4℃保存）；洗脱缓冲液：含50mmol/L NaCl、0.1mmol/L PMSF和5mmol/L EDTA的Tris-HCl（pH 7.5）。②染色质鉴定：测量每个组分在260nm处的吸光度（ A值）；在EP管内分别加入0.5μg的组分S1、S2和P，加入2μl上样缓冲液和1μl 10% SDS，将体积调整到10μl，轻柔混合；用1×TBE缓冲液和标准1%（ W/ V）琼脂糖胶进行电泳，并用100bp DNA ladder作为分子量标准，让电泳的条件处于2～3V/cm，直至上样液中走的最快的蓝色迁移到胶的中央部分；用含10μg溴化乙啶的500ml H ₂O在平皿中对胶染色30分钟；用15ml H ₂O冲洗胶15分钟除去染色背景；在紫外灯下观测染色质片段大小。③染色质和抗血清的孵育：将10～20μg S1组分和10～20μg S2组分在1.5ml EP管中轻柔混合，用ChIP培育缓冲液将体积调整到1ml；加入5～10μg所选择的抗体，封闭管口，在4℃摇床（20～30r/min）上孵育12～16小时，在此期间，抗体会与特异性抗原表位结合。④准备A或G蛋白琼脂糖：将0.25g A/G琼脂糖微珠放到14ml聚丙烯管中，加入1ml水润湿微珠；用10ml水洗涤，1500×g离心3分钟，弃上清，重复4次；用1ml无菌水重悬，分装于10个1.5ml EP管中，4℃保存。⑤免疫染色质抽提：免疫沉淀后，在每个管中加入50μl A/G蛋白琼脂糖，4℃ 20～30r/min旋转4小时，1500×g离心3分钟，将上清转移到2ml EP管中，此管为未结合组分，包含未与抗体连接的染色质；用1ml洗涤缓冲液A重悬，将重悬液转移到15ml Falcon管中，用洗涤缓冲液A补充体积到10ml，混匀；4℃ 1500×g离心3分钟，弃上清；用10ml洗涤缓冲液B重悬，混匀；4℃ 1500×g离心3分钟，弃上清；为了从已经洗涤过的微珠上洗脱染色质，将琼脂糖微珠颗粒用500μl洗脱缓冲液重悬，转移到1.5ml EP管中；室温20～30r/min旋转30分钟，250g离心3分钟，将上清转移到2ml EP管中，此管为结合组分。

①主要材料：苯酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1（ V/ V/ V）；TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、1mmol/L EDTA；6×上样缓冲液：30%（ V/ V）甘油水溶液、0.25%（ W/ V）溴酚蓝、0.25%（ W/ V）二甲苯青（4℃保存）。②从沉淀染色质中抽提DNA：在结合和未结合组分中加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1（ V/ V/ V），混匀；15 000×g离心15分钟；将上层水相转移到另一个2ml EP管中，加入NaCl至终浓度250mmol/L；加入20～40μg糖原，混匀；加入1体积异丙醇，混匀，在-80℃至少保存2小时，18 000×g离心15分钟，弃上清；加入1ml 70%（ V/ V）乙醇洗涤沉淀颗粒，18 000×g离心5分钟，弃上清；室温干燥沉淀颗粒5～10分钟，用10～50μl TE缓冲液重悬沉淀颗粒。③沉淀染色质的测定：测定每个样品的OD ₂₆₀值，用以决定接下来PCR扩增时要使用的模板数。通过PCR定量DNA后可进一步计算出组蛋白乙酰化水平。PCR的具体步骤不再累述。

1）为防止蛋白的分解，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。测定组蛋白乙酰化时，或者如果需要在同一细胞或组织中同时测定组蛋白乙酰化和甲基化时，需要在纯化细胞核和加入物染色质制备溶液中加入丁酸钠（至终浓度5mmol/L）。丁酸钠可阻止内源性组蛋白去乙酰化酶所导致的组蛋白乙酰化丢失。

2）鸡抗血清同A蛋白和G蛋白的结合情况都不好，因此，在抗体孵育结束后需再加入5μg兔抗鸡抗血清进行第二个沉淀反应，时间为3～4小时，然后抽提抗体-结合染色质。

3）结合组分DNA同总起始物质之间的比率显示了ChIP实验的效率，代表了免疫沉淀染色质的百分比。在组蛋白修饰标准实验中，只有15%的非变性染色质被沉淀下来。总沉淀比率依赖于组蛋白修饰的特点和丰度，以及所用抗体的亲和力和浓度。感兴趣位点的修饰后组蛋白沉淀效率在很大程度上依赖于这种修饰是否是普遍存在的。比如，H3K4甲基化是一种稀有的修饰，会在其位点上引起高效率的沉淀，其原因是：加入的抗体总量已足以将所有含有这种特定修饰组蛋白全部沉淀下来，但如果这种修饰是普遍存在的，则加入规定量的抗体（5～10μg）并不足以沉淀所有含有此修饰的染色质。

4）应在实验应用之前仔细评估抗体的质量和特异性，要考虑的问题包括：其他组蛋白修饰位点的交叉反应、对未修饰（重组）蛋白的识别以及与细胞核中其他物质的交叉反应。这种类型的评价程序涉及对核提取物进行针对于重组组蛋白的免疫印迹，或对在硝化纤维膜上的一组修饰过的和未被修饰过的多肽进行免疫印迹。针对抗PTM组蛋白抗体的质量问题，抗体验证数据库对200多个针对57种不同组蛋白修饰的抗体进行了总结 ，记录了不同抗体在斑点杂交、免疫印迹（在不同的物种中）、ChIP测试中的性能，是该研究领域中一种极好的资源。

5）考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则残存在上清液中。缓冲液太少不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。

6）染色质MNase分离时，时间和酶剂量需按照细胞类型的不同而调整。

包括ChIP的免疫测序法需要使用专一性抗体，抗体制备昂贵，有些抗体很难制备，而且多种修饰的共存会导致抗原决定簇的封闭，更重要的是抗体不能单独地用于鉴定新的、未知的修饰位点。目前质谱（MS）技术在鉴定组蛋白修饰位点方面具有快速、精确、高灵敏度和高分辨率等优点，引起了人们的密切关注。质谱是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（质量-电荷比）或质量的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能用高能电子流等轰击样品分子，使该分子失去电子变为带正电荷的分子离子和碎片离子，通过适当的电场、磁场，将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并在检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。质谱分析方法通过正确测定离子化生物分子的质荷比便可得到相关分子的质量。20世纪70年代，解析技术的出现使之成功地应用于蛋白分子和核酸分子的分析。随着质谱技术的不断发展，质谱成为组蛋白定性和定量分析及检测组蛋白修饰动态变化的有力工具。

这一策略通常是将提纯后的组蛋白酶解成多肽，然后用液相色谱和串联质谱技术（LC/MS/MS）分析酶解多肽，最后采用生物信息检索分析多肽序列和修饰位点。采用“Bottom-up”策略全面分析组蛋白H1、H3或H4证明，质谱可以精确地证实先前已知的修饰位点，并发现新的修饰位点。目前，“Bottom-up”策略广泛地用于鉴定组蛋白，确定组蛋白氨基酸序列和PTM，是当前组蛋白修饰鉴定的主要策略。但是该策略存在一些缺陷，如鉴于组蛋白结构的特殊性，酶解组蛋白的一些肽段可能太短不适合质谱分析，导致肽段的漏检；同时，水解后产生的肽段数量太多，使得样品更加复杂，而且多种修饰间的相互作用信息在酶解后会随之丢失。

该策略通常是将组蛋白直接引入到质谱中进行分析，通过碎片裂解技术将组蛋白裂解成多肽的碎片分子，得到蛋白质和碎片离子的质量，采用生物信息检索推演多肽序列和修饰位点。目前，这一策略在组蛋白及其PTM分析方面得到密切关注。采用“Top-down”策略能够检测到几乎所有组蛋白肽段信息，从而能够完整地描述组蛋白的结构组成，并鉴定出几乎所有修饰和突变信息。然而，由于蛋白质大分子质谱离子化效率低，低丰度蛋白形式难以检测，而且产生的碎片离子谱图解析较困难，因此该策略的广泛应用仍需要技术上的改进。

除了检测组蛋白和肽的准确分子质量之外，根据二级质谱的碎片离子信息可推测多肽序列的精细结构。常见的碎片离子裂解技术主要有：碰撞诱导解离（CID /CAD）、电子捕获解离（ECD）、电子转移解离（ETD）等。其中，CID 技术裂解时多肽断裂程度低，同时，PTM的存在会使断裂更容易发生在非酰胺键处，从而导致肽骨架信息和PTM信息的丢失和错乱，因此，并不适用于组蛋白修饰的检测。

该技术是由McLafferty等发明的针对粒子回旋共振（FT-ICR）质谱的裂解技术，它是将电喷雾所产生的组蛋白肽段或整个组蛋白引入到傅里叶变换质谱仪（FTMS）的离子回旋共振池（ICR）中，肽段或整个蛋白被一束亚热态的电子照射，沿着Cα-N键处断裂，产生互补的c-系列离子（碎片离子N端带有电荷）和z-系列离子（碎片离子C端带有电荷）。ECD 技术对蛋白质和多肽的裂解覆盖程度高、PTM基团不会丢失，因此，这一技术适用于鉴定组蛋白PTM研究。

ETD是一种新的裂解技术，通过将电子从活泼的阴离子自由基上转移到带正电荷的肽段上，诱发肽段主链发生Cα-N键的断裂，产生互补的c-和z-系列离子。它能够很好地裂解带有高电荷的肽段和蛋白质，得到几乎完全断裂的肽段。它的另一个优点是能够分析分子量大的较长肽段，从而能同时检测到共存的多个PTM。

利用质谱技术可以快速、准确地发现组蛋白PTM的位点，还能发现不同的组蛋白变体及其上的结构信息。

第一个利用质谱技术发现的新的组蛋白修饰是位于H4R3上的单甲基化，随后利用肽质量指纹谱和MS/MS实验证实了组蛋白H3K79上也有甲基化修饰，进一步的生物学实验证实了这些位点上的修饰在端粒区域中对基因的激活具有重要的作用。此后，质谱技术陆续发现了其他新的组蛋白修饰位点。近期，结合新的质谱分析技术和PTMap蛋白修饰鉴定专门软件，可验证新的PTM形式。表面增强激光解析离子化飞行时间质谱系统（SELDI-TOF）是一个高通量、高灵敏度的蛋白组学技术平台，可结合抗组蛋白抗体为捕获基质的蛋白质芯片用于分析组蛋白修饰状态。

组蛋白H2B、H2A和H3都有很多结构相近的家族成员（它们仅在氨基酸序列上有差异），会导致染色质状态的变化。基于质谱技术的“Top-down”策略鉴定了来自人类细胞的组蛋白H2A和H2B的突变体，使用ECD技术发现H2B拥有7种变体，而编码组蛋白H2A的基因中至少有14种基因表达。在组蛋白H2B或H2A，甚至在用去乙酰化抑制剂处理的情况下，只发现有适度的PTM，这与已知高度修饰的组蛋白H3和H4相反。用“Bottom-up”策略分析相同的两个组蛋白（H2A和H2B）也发现相似的蛋白形式和修饰，质谱技术也已成功地应用于鉴定组蛋白H2A的稀少变体的PTM。蝇类、植物和人类的组蛋白H3突变体的PTM情况由定量质谱方法鉴定后发现一些具有丰富的PTM的突变体，其与基因的抑制或激活密切相关。鼠类和人类的组蛋白H1有6种突变体，已经应用质谱技术分析了鼠类的组蛋白H1突变体。

定量蛋白质分析能够动态地检测细胞内蛋白修饰的丰度变化、发现蛋白修饰的功能、辨别与疾病的相关性。首先应用于组蛋白定量研究的是无标记的质谱定量技术，如应用反相-高效液相色谱/质谱（RP-HPLC/MS）技术监测组蛋白修饰水平及其变化；应用LC/QTOF MS和高效毛细管电泳（HPCE）联用技术检测组蛋白中全面的修饰形式。基于分析和计算机策略的无标记质谱法可以在肽水平上获得所有4个核心组蛋白修饰的相对量。核素标记法与质谱联用策略是目前定量蛋白组学的主要手段。在细胞培养过程中用稳定核素标记氨基酸来标定蛋白质（SILAC法）是将天然核素或稳定核素标记的必需氨基酸添加到细胞培养基中以支持细胞的生长，经过一定数量的细胞倍增后，稳定核素标记的氨基酸可添加到细胞新合成的蛋白质里，不同标记的细胞裂解蛋白以细胞个数或蛋白量等比例混合，经过分离、纯化后利用质谱鉴定和定量。这一定量蛋白组学策略是一种直接的标记过程，省略了除去过量标记试剂的提纯步骤，而且标记效率能接近100%。将此方法与醋酸尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（AU-PAGE）和基质辅助激光电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术结合已用于检测人类淋巴母细胞恶性肿瘤系697中组蛋白H4上乙酰化的动态变化。Hunt等开发了一种将肽的羧基转化为它们相应的乙酯的稳定核素标记策略，这一方法已经成功应用于监测组蛋白H3上修饰水平的变化。另外，可用氘代醋酸衍生化未修饰的赖氨酸残基，并且用新的计算机算法定量CAD片段离子，这一方法能有效地测定在组蛋白H4上发生乙酰化修饰的残基的百分数。

在组蛋白修饰研究领域，芯片技术以其高通量、微型化和自动化的优点，逐渐被研究者广泛采用。芯片技术的研究对象是基因或蛋白质，其基本原理是对玻片、凝胶、微孔板等各种固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的基因或蛋白分子产物有序地固定其上，形成微阵列，然后通过标记了的生物分子与芯片作用，捕获能与之特异性结合的待测基因或蛋白，经洗涤，将未能与芯片上的基因或蛋白质互补结合的成分洗去，再利用检测技术分析基因或蛋白质与生物分子之间的相互作用关系。芯片技术可用于研究蛋白质-DNA、蛋白质-配基和蛋白质与蛋白质之间的相互作用。芯片技术的特点有四个：①通量高，在一次实验中可同时检测上千种目标；②灵敏性强，可以检测出样品中微量目标的存在；③特异性强，这是由抗原抗体之间、配体之间的特异性结合决定的；④应用性强，使用方便、快捷。

ChIP后大规模富集分析可利用大规模并行DNA测序方法来进行。这些方法可以对数百万的DNA分子进行实时并行测序。迄今公布的ChIP-测序研究绝大多数是使用“边合成边测序”的平台来完成的，这个平台的基础是在一个芯片表面对几百万的DNA克隆簇进行并行测序，这种将ChIP与芯片结合的技术被称为ChIP-chip。ChIP-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法（in vivo footprinting）相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。目前ChIP-chip技术应用主要集中于两个研究领域：转录因子的结合和条件特异性；组蛋白的修饰和染色体重建。如果组蛋白修饰位点是未知的，那么ChIP-chip就可以确定基因组中带有特定组蛋白修饰的区域。在这个方法中，用不同的荧光素标记免疫沉淀的DNA片段，然后，样品杂交于带有DNA探针的芯片，免疫沉淀复合物中某个DNA片段的富集与基因组中特定区域的组蛋白特异修饰相关。ChIP和ChIP-chip可以提供某个启动子上组蛋白修饰的信息，修饰状态变化的动力学，以及在某个基因或调控序列中或在整个基因组中组蛋白修饰所在的位置。ChIP-chip 技术的优点是，微阵列本身是包被在玻璃载玻片上几万至数千万的寡核苷酸，基于微阵列的方法能够对许多位点的组蛋白修饰富集情况同时进行分析。蛋白质富集的位点可以通过将荧光标记的来自于免疫沉淀产物和投入组分的DNA一起共杂交到阵列上，并比较阵列上标准化的免疫沉淀/投入荧光强度比来确定。缺点是：需要特异性蛋白质抗体，有时难于获得；为了获得高丰度的结合片段，必须实验模拟胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质基因的获取可能需要限制在组织来源中。总之，ChIP-chip技术的发展为分析活细胞或组织中DNA与蛋白质的相互关系提供了一个极为有力的工具。

要准备用于微阵列分析的DNA时，第一步是从每个测试（免疫沉淀产物）和对照样品中扩增出所要的DNA，并将扩增产物用两个不同的荧光基团分别标记。DNA扩增可以用多种方法来实现，基于PCR的方法是先将引物结合位点加到DNA两端，可以通过将DNA连接到序列已知的短接头上，或者使用含有3′兼并序列和5′已知序列的引物先进行两轮退火和延伸。末端带标签的产物可以用能识别加入接头序列的引物再进行几轮PCR进行扩增。DNA扩增的另一个广泛使用的方法涉及将DNA转换成转录模板，再用T7 RNA聚合酶转录从而对产物进行线性扩增。首先，将短的polyT尾添加到DNA 3′末端来产生一个可利用聚合酶进行第一链合成的引发位点。用于引发的寡核苷酸中在基础T7 RNA聚合酶启动子序列的3′端有一串A，这能使得第一链的产物能通过体外转录来进行后续的扩增。PCR扩增得到的样品可以通过以下两种方式之一进行荧光标记：①在最后一组PCR中引入荧光基团修饰过的dNTP；②使用氨基修饰的dNTP，之后间接地再将染料偶联上去。除了修饰过的核苷酸是在最后的反转录步骤中被引入的以外，同样的标记原理也可用于通过转录进行扩增的产物。在准备用于标记的样品时，重要的是还应标记一个可以与待测样本一起共杂交的合适对照样本。在最后扩增或标记完以后，将样品进行纯化，再将已标记的待测和对照样本混合在一起，准备进行杂交。样品注射到表面包被有与连接产物接头序列互补的寡核苷酸的芯片上。锚定的寡核苷酸的密度可以保证在扩增步骤中新合成的分子均出自于附着在邻近芯片表面的引物，使得DNA在空间上始终靠近原模板。测序阶段则是利用荧光标记的且可以可逆性终止延伸过程的核苷酸进行单碱基延伸来完成。一个带标记的核苷酸添加到游离的3′末端，随后延伸暂停，以便检测掺入的核苷酸。接着，切除掉终止基团，从而可以加入下一个核苷酸。核苷酸延伸需要再重复几个循环，通常会产生40bp左右的读长。

除与基因芯片相结合外，ChIP还可与蛋白质芯片技术联用。蛋白质芯片技术是能够同时筛选探针蛋白与多个多肽间相互作用的基于阵列的方法。它能够提供一份涵盖整个基因组序列位点的组蛋白乙酰化/甲基化表达图谱，帮助研究者选择出有研究意义的位点，再针对性进行具体研究。该多肽微阵列通常是一块经抗生蛋白链菌素包被的、且有不同的生物素标记的多肽的载玻片，待测蛋白在多肽微阵列的表面孵育。蛋白质多肽复合物可以用结合有荧光基团的抗体和阵列扫描仪检测，也可相反地用荧光标记的多肽孵育蛋白质阵列。除检测修饰后蛋白外，蛋白质芯片另一个重要的应用是检测蛋白PTM的分子机制，其中最重要的一步是识别不同类型酶的底物，如蛋白乙酰转移酶和蛋白甲基化酶等。蛋白质芯片可以直接进行乙酰化等修饰反应研究，从而识别这些酶的直接蛋白靶标。应用蛋白质组芯片，一个生物体或者蛋白质组中编码的绝大部分蛋白都可以用于检测酶-底物之间的相互关系，因此这是蛋白质PTM研究领域的一个直接的、全面的方法，可识别出许多新的PTM位点，以及新的PTM类别，这正好弥补了质谱技术的最大弱点，即无法确认PTM的上游酶。然而像蛋白质芯片技术这样大规模、高通量方法的数据集中总是存在假阴性和假阳性结果，因此要鉴别出PTM位点既需要大范围覆盖性，又需要深入的质谱分析。

不同类型的微阵列已被用于研究蛋白质结合的相互作用和PTM，然而这些研究不能在体外条件下全面地反映体内的情况和代表特定的生物条件，因此需加上具有蛋白质微阵列功能的细胞提取物来分析在体内环境中PTM的改变，研究其复杂的过程。用于功能性提取物补给的可以是试剂、基质、酶、酶抑制剂、药物、抗体或者混合物，其作用是增强或消耗某些修饰反应。其方法是：先将浓缩的细胞提取物在微阵列进行孵育，被标记蛋白用提取物/样品修饰。在反应完成时，洗掉提取物，并用检测抗体孵育阵列。然后再次清洗微阵列并晾干，然后用适宜的扫描器进行解读。扫描生成的图像文件包含阵列中所有斑点的信号强度值以及每个斑点局部背景水平。使用定量分析软件，显示出阵列上的每个斑点的反应水平，可以计算出每个蛋白质信号强度（如信噪比）。最后，用不同提取物/样品孵育的蛋白质微阵列可比较并识别出不同修饰的蛋白质。

蛋白对修饰的偏好性可以通过比较该蛋白对不同修饰的多肽的相对亲和力来确定。利用固定在微珠上的多肽（重组蛋白或核提取物）将待测蛋白沉淀下来，并使用免疫印迹来测定蛋白质的相对回收率。将短肽作为诱饵分子的原理也已用于发现未知的组蛋白PTM结合蛋白。在该测试中，相对于未修饰过的多肽或在不同氨基酸上带有相同修饰的多肽，根据在修饰过的多肽上的富集，可以确定核提取物中的结合蛋白。如果特定的修饰明显富集于含有靶蛋白的复合物中，就可结合更多的修饰过的多肽。在无法确定这种倾向性的情况下，仍然可知道这种结合是否为修饰依赖性的。相较于未修饰过的组蛋白，与修饰过的组蛋白的相对亲和力可以利用天然组蛋白和重组组蛋白、通过结合测试加以比较和确定。

为验证特异性修饰组蛋白功能，有时需要在体外重组这类组蛋白。制备位点特异性修饰组蛋白的方法涉及蛋白质片段的体外连接，这种方法的前提是将一种人工合成的、修饰过的肽段（对应到蛋白质的N-或C-末端）通过化学方法连接到含有其余蛋白质部分的重组片段，然后对全长度连接产物进行纯化。利用天然的化学连接，通过依次加入对应于连续的蛋白质部分的合成肽段，可制备一个全合成的修饰组蛋白。比如，将一个已经经过序列优化的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶变异体导入大肠埃希菌，从而使识别的tRNA CUA带上乙酰化赖氨酸。通过化学连接，使用经遗传改造过的、能在UAG密码子处引入乙酰化赖氨酸的大肠埃希菌，可以通过体内直接引入来制备赖氨酸乙酰化的组蛋白。因此，为了产生一个位点特异性乙酰化的组蛋白，只需要在菌株中加入待修饰位点含有UAG密码子的构造就可以了。当重组组蛋白以单体形式过度制备时是不可溶的，但是可以从包涵体中回收过表达的蛋白。首先，可以从分别过表达每种组蛋白的细菌培养物中得到包涵体。再从包涵体中提取组蛋白，经连续离子交换树脂纯化，并采用线性盐梯度进行洗脱。要生成组蛋白八聚体的话，等摩尔的H3、H4、H2A和H2B要先展开、组合、通过透析复性，再经分级柱纯化。

一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）共同调控。HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。

在组蛋白乙酰化和去乙酰化之间平衡的操作，是通过特定HDAC抑制物来进行的，特定HDAC抑制物控制的组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡是研究控制细胞转录和其他细胞活动中组蛋白乙酰化程度的强有力工具。根据其结构，HDAC抑制剂分为5类：①短链脂肪酸，如丁酸钠；②异羟肟酸；③含有2-amino-8-oxo-9、10-epoxydecanol组分的周期肽段，如Trapoxin A；④缺乏2-amino-8-oxo-9、10-epoxydecanol组分的周期肽段，如Apicidin；⑤苯甲酰胺，如MS-27-275。其中，曲古抑菌素A（TSA）是一种低浓度能抑制HDAC的异羟肟酸（hydroxamic acid），被广泛应用于体内外组蛋白乙酰化研究。它可以可逆地结合在HDAC催化位点的活性位点上，与锌离子相互作用，从而促进细胞中乙酰化组蛋白的累积。除了对HDAC催化活力的直接抑制，TSA还可以加速HDAC1的降解。在这些不同机制中，TSA对HDAC的关键抑制可以发生在纳摩尔浓度级别上。然而在体外，TSA对于组蛋白乙酰化处理和基因激活的效率是受大量因素影响的，包括细胞类型、培养基、细胞密度和培养时间等。比如，只有当细胞培养在合适密度以及处于指数生长期的时候，细胞才会对TSA处理起反应，细胞密度高过临界阈值的话，可能会降低甚至抵消TSA对乙酰化敏感基因的影响。以下以TSA为例，讲述HDAC抑制剂的处理及处理后组蛋白乙酰化状态的鉴定。

在静息T淋巴细胞中，经TSA处理后的人类端粒反转录酶（hTERT）基因可以作为说明HDAC抑制通用方法的模型。静息T淋巴细胞中hTERT mRNA水平非常低或者检测不到，而TSA对T细胞进行处理后，hTERT表达会呈现出随时间和剂量增加而增加的显著上调，这是由于在hTERT启动子区域乙酰化组蛋白水平的增加所致。TSA以时间依赖性方式抑制HDAC活力，诱导组蛋白乙酰化，如果处理时间较短，hTERT mRNA的水平不能被充分诱导至最高水平，然而细胞长时间暴露在TSA环境中可能对其有害，因此，在静息T淋巴细胞用TSA处理后，先用PCR检测各个时段hTERT表达情况，进而确定最优培育时间。TSA也以剂量依赖方式提高hTERT表达。在一个确定的范围内（低于毒性浓度），TSA对基因活性的影响与培养基中的浓度成正比。由于不同来源的细胞对TSA有不同的敏感性，需要在实验中测试多个TSA的浓度，RT-PCR检测hTERT mRNA的表达情况，选出最佳条件。

有许多方法可以检测TSA对HDAC抑制作用的效率。ChIP被广泛用于检测HDAC抑制剂处理后乙酰化组蛋白和它们目的基因之间的联系。乙酰化组蛋白经常是在聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离后，用点杂交的方式进行检测，大量组蛋白在醋酸/尿素/Triton X-100（AUT）胶上分离后，用考马斯蓝染色或者进行Western blot。值得注意的是，由HDAC抑制剂所诱导的组蛋白H3和H4的乙酰化并不总是发生在相同时间和具有相同程度。