二、实验操作
1.所需试剂及配制试剂
（1）1.37% 甲醛。
（2）1mol/L甘氨酸：①3.75g 甘氨酸；②50ml水。
（3）20倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）：①160g NaCl；②4g KCl；③2.88g Na 2HPO 4；④4.8g KH 2PO 4；⑤1L 超纯水；⑥调整pH到6.4得到20X PBS储存液；⑦取50ml储存液加超纯水至1L得到1X PBS。
（4）100mmol/L 苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）：①0.174g PMSF；②10ml纯乙醇；③分装储存于-20℃（使用终浓度为1mmol/L PMSF，其半衰期仅有30分钟，所以每次使用时新鲜配制）。
（5）细胞裂解液：①44mmol/L Tris-盐酸，pH 8.1；②1% SDS；③10mmol/L EDTA；④10mmol/L 丁酸钠（测组蛋白乙酰化时使用）；⑤使用前加入蛋白酶抑制剂复合物：1mmol/L PMSF、10μg/ml 抑酶肽（aprotinin）、10μg/ml 亮抑酶肽（leupeptin）、10μg/ml抑胃肽（pepstatin）。
（6）稀释缓冲液：①16.7mmol/L Tris-盐酸，pH 8.1；②250mmol/L NaCl；③0.01% SDS；④1%Triton-X-100。
（7）A/G蛋白琼脂糖/鲑鱼精DNA（Protein A/G-agarose/Salmom sperm DNA）。
（8）低盐洗涤缓冲液：①20mmol/L Tris-盐酸，pH 8.1；②150mmol/L NaCl；③0.1% SDS；④1% Triton X-100；⑤2mmol/L EDTA。
（9）高盐洗涤缓冲液：①20mmol/L Tris-盐酸，pH 8.1；②500mmol/L NaCl；③0.1% SDS；④1% Triton X-100；⑤2mmol/L EDTA。
（10）氯化锂洗涤缓冲液：①10mmol/L Tris-盐酸，pH 8.0；②0.25mmol/L LiCl；③1% NP-40；④1% Deoxycholate；⑤1mmol/L EDTA。
（11）1X TE缓冲液：①10mmol/L Tris-盐酸，pH 8.1；②1mmol/L EDTA。
（12）洗脱缓冲液：①0.1mol/L M NaHCO 3；②1% SDS；③5mmol/L NaCl。
（13）5mol/L NaCl：①58.4g NaCl；②200ml超纯水。
（14）RNase A：①0.1g RNase A；②10ml 水；③溶解后储存于4℃。
（15）蛋白酶K：①50mg 蛋白酶K；②2ml 超纯水；③分装储存于-20℃。
（16）苯酚/氯仿/异戊醇抽提液（phenol/chloroform/isoamyl alcohol）：苯酚是高腐蚀性试剂，使用时应特别小心。
（17）糖原（glycogen）：20mg/ml。
2.所需器材
（1）细胞刮子。
（2）超声波细胞破碎仪。
（3）摇床。
（4）涡旋振荡器。
（5）振荡培养箱。
（6）不同大小规格的移液器及吸头 （5～1000μl）。
（7）微量离心机。
（8）水浴箱。
（9）恒温培养箱。
（10）PCR设备。
3.操作步骤 （1）细胞样本的制备：
①取准备好的细胞，37%甲醛直接加入细胞培养液中，使得甲醛的终浓度为1%，在室温下孵育细胞20分钟，充分交联DNA和靶蛋白。如果研究组蛋白乙酰化，则推荐固定前加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（20mmol/L）。②加入甘氨酸至终浓度为0.125mol/L终止交联，混匀后，室温下继续孵育5分钟。③弃去培养液，用预冷的含蛋白酶抑制剂的PBS清洗细胞两次。使用细胞刮子收集细胞于离心管中，4℃下，2000r/min离心5分钟。小心弃去上清液，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液200μl，混匀后，冰上孵育10分钟（每1×10 6个细胞加入200μl裂解液）。④超声破碎细胞，剪切DNA为200～1000bp大小，整个超声过程在冰上进行并尽可能避免泡沫产生。⑤超声破碎后，在4℃下，13 000r/min离心15分钟，取上清液，弃去沉淀物。此时，上清液可以-80℃保存备用。
（2）免疫复合物沉淀及清洗：
①标本上清液使用加蛋白酶抑制剂的稀释缓冲液稀释10倍，即200μl的上清液加入1800μl的稀释缓冲液。取20μl作为PCR反应备用。为减少非特异性背景及假阳性，可加入75μl A/G蛋白琼脂糖/鲑鱼精DNA，4℃下振荡30分钟。②在4℃下，3000r/min离心5分钟，收集上清液，加入免疫沉淀级别相应抗体（加入量参考抗体说明书，一般加入5～10μg），4℃摇转孵育过夜。③孵育过夜后，加入60μl A/G蛋白琼脂糖/鲑鱼精DNA，在4℃下继续摇转1小时。④在4℃下，3000r/min离心2分钟，小心弃去上清液，依次用以下洗涤液1ml清洗沉淀复合物3～5分钟：低盐洗涤缓冲液洗一遍；高盐洗涤缓冲液洗一遍；氯化锂洗涤缓冲液洗一遍；TE缓冲液洗两遍；清洗完毕后，加入250μl洗脱液到免疫沉淀中，振荡混匀，室温下摇转孵育15 分钟。静置离心后，收集上清液，重复洗脱一次。合并两次上清液，最终的洗脱液量约为每管500μl。
（3）逆转交联和DNA的纯化：
①在合并的洗脱液（500μl）中加入20μl的5mol/L NaCl，混匀，65℃逆转交联4小时或者过夜。在这一步，标本可保存于-20℃。②逆转交联后，加入1μl RNaseA，37℃孵育1小时，而后加入10μl 0.5mol/L EDTA、20μl 1mol/L Tris-盐酸，pH 6.5和2μl 10mg/ml的蛋白酶K，45℃继续孵育1小时。③纯化DNA可以使用DNA纯化柱或者使用标准的苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化。如果用苯酚/氯仿抽提DNA，为了更清晰呈现DNA沉淀，可加入20μg糖原或者酵母tRNA。然后是用70%乙醇清洗沉淀，晾干。④最后加50μl超纯水重悬DNA沉淀，用于后续DNA鉴定，见注意事项第7条。