第二节 酶的结构与功能

酶分子结构与蛋白质一样，具有一级、二级、三级结构，有的还有四级结构。

到目前为止，许多酶的一级结构已经研究清楚，有的二级、三级和四级结构也已阐明。

例如，牛胰核糖核酸酶，其相对分子质量为14000u，由124个氨基酸组成，只有一条肽链。N末端为赖氨酸，C末端为缬氨酸，肽链上的8个半胱氨酸通过4个二硫键连接（图4-17）。

在研究一级结构时，必须交替使用多种手段来揭示酶和其他蛋白质的全部序列。如酶蛋白有一个以上的肽链，首先把多肽链彼此分开，一条多肽链卷曲而成的二硫键也要打开，然后切开特定的肽键，把多肽链切为较短的肽。可用酶法，也可用化学方法达到这个目的。用酶法时所用的酶称为蛋白水解酶或肽酶。自然界存在很多种这样的酶，其中有些作用能力很强，几乎能催化多肽链中全部肽键的水解，只剩下自由氨基酸或很短的肽，如木瓜蛋白酶、耐热蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等，但它们的键专一性较差。因此，在实际操作时要严格控制。例如，枯草杆菌蛋白酶，控制在0℃下几分钟后，便能有效地切断Ala21和Ser22间的肽键（图4-17）。

可引起肽键专一性水解的化学方法，最广泛使用的是溴化氰（CNBr）法，它在甲硫氨酰残基处引起裂解，如图4-18所示。

此反应结果产生的一个肽是原来肽段甲硫氨酰残基为止的N端部分，现在这个肽的C末端为高丝氨酸内酯。产生的另一肽是原来肽链的C端部分。

把蛋白质的一级结构分裂为较小的肽链碎片后，用色层方法把它们彼此分离提纯。在一定条件下，有些片段可用自动氨基酸序列测定法测定它们的序列。

牛胰核糖核酸酶的二级结构为α-螺旋结构，酶分子中的四个二硫键中的三个在螺旋体中侧向按三个不同的方向连接两个平行的螺旋环圈。其第4个二硫键所连结的第65号和第72号半胱氨酸以及其间的六个氨基酸则位于螺旋环圈的内侧。

大多数酶只由一条肽链组成，有的酶有两条、三条或多条肽链组成，这种由数条相同或相似的肽链组成的酶呈四级结构，其中每一条肽链称为一个亚基。具有四级结构的酶通常含2～6个亚基，个别的含有几十个。四级结构破坏时，亚基即分离。

一般而言，绝大多数酶是具有催化功能的一类蛋白质。但是，其所催化（或作用）的底物不一定是大分子物质，酶是大分子的物质，但是其所起催化功能也不是所有结构部分。此问题涉及酶的分子结构与催化功能关系问题。

一、酶活性部位概念

酶学研究认为，在酶分子上，不是全部组成多肽的氨基酸都起作用，而只有少数氨基酸残基与酶的催化活性直接相关。这些特殊的氨基酸残基，一般比较集中在酶蛋白的一个特定区域，这个区域称为酶的活性部位或活力中心（active site or active center）。按1963年Koshland的提法，活性部位是由酶蛋白分子中少数几个氨基酸残基（包括含辅基、辅酶、金属离子）组成。它们在蛋白质一级结构的位置可能相差甚远，当肽链折叠、盘绕时，使得它们在空间位置很接近，构成一个特定的空间区域。因此，活性部位不是一个点或一个面，而是一个小的中心区域。所以，酶的活性部位的提法较为确切，但也有人称为活力中心。

酶活性部位包括底物结合部位（combining site of substrate）和催化部位（catalytic site）。前者只有与相适应的底物分子才能结合（如底物分子大小、形状及电荷等），决定着酶的专一性。而后者在催化反应中直接参与电子授受关系的部位（含酶的辅酶或金属部分）。例如，胰凝乳蛋白酶的活性部位是采用化学修饰及X射线衍射等方法进行研究的。利用一种对丝氨酸有特异性的标记来和丝氨酸上的羧基起共价化学反应，然后再加以测定。在各种标记剂中，二异丙基氟磷酸（DFP）最有效，10-10mol/L的DFP即可使酶活性部位上丝氨酸的羧基起共价修饰作用，其反应式如图4-19所示。

上述形成的酶与丝氨酸共价修饰复合物，实际上DFP把肽链上的丝氨酸残基保护起来，然后，再用放射性32P标记的DFP来进行上述反应，可得到放射性的O-磷酰丝氨酸，活性部位的丝氨酸（Ser-195）由此被证实，它是直接参与催化作用的结合部位。另外，动力学研究证明，有一个pK在6～8的解离基团（His-57）与催化反应有关。因此，胰凝乳蛋白酶形成Ser-195-His-57-Asp-102的电荷接力系统，形成酶的活性部位。

采用同样的方法确定了RNA酶的活性部位由Lys-41、His-12-His-119组成；溶菌酶由Glu-35、Asp-52组成；木瓜蛋白酶由Gys-25、His-159组成；羧肽酶由Glu-270、Tyr-245、His-196-Zn-His-69组成等。

Glu-72

由于基因工程的发展，研究酶活性部位方法有了很大改进，可以采用对一个酶的编码基因进行定位突变，这样可以任意地改变酶分子上任何一个位置的氨基酸残基，然后再检测其与酶活力的关系，从而测定其酶的活性部位。

二、别构部位（allosteric site）

酶分子不仅能起催化功能，同时也具有调节功能。因此，在酶的结构中不仅存在着酶的活性部位（或活力中心），而且存在调节部位（或调节中心），称为别构部位（allosteric site）。这一概念是1963年Monod等提出的。别构部位不同于活性部位，活性部位是结合配体（底物），并催化配体转化，而别构部位也是结合配体，但结合的不是底物，而是别构配体，这种配体称为效应剂。效应剂在结构上与底物毫无共同之处，效应剂结合到别构部位上引起酶分子构象上的变化，从而导致活性部位构象的变化。这种改变可能增进催化能力，也可能降低催化能力。增强催化活力者称为正效应剂，反之，称为负效应剂。例如，天冬转氨甲酰酶存在活性部位，也存在别构部位，这一酶同时具有催化功能和调节功能（图4-20）。

图4-20中，代谢反应中的CTP是天冬转氨甲酰酶的负效应剂，其结构与该酶底物毫无相似之处，但它能和酶的调节亚单位结合并引起其结构上的变化，从而钝化酶活力，达到调节作用。但不是所有的酶都具有别构部位，受别构调节控制的酶，一般为寡聚酶，即具有四级结构的酶。

具有别构部位的酶和其他恒态酶在动力学性态上是不同的，它往往偏离米氏动力学方程，酶反应速度与底物浓度间不是呈矩形双曲线关系，而是呈S型曲线或表观双曲线特征。

三、酶原（proenzyme）

酶是由活细胞合成的，但不是所有新合成的酶都具有酶的催化活性，这种新合成酶的无催化活性的前体称为酶原。就生命现象而言，酶原是酶结构一种潜在的形式，如果没有这种形式，生命就会停止。例如，哺乳动物的胰脏分泌到消化系统中的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原，每种酶原都是由二硫键交联的单一多肽链组成。它们在到达十二指肠以前，一直是十分稳定的，而到达十二指肠后则被另一种蛋白质水解酶所活化，这种活化过程是从无活性酶原转变成有活性酶的过程。该种酶原往往由该种酶所激活，称为酶原的自我激活，其反应式如图4-21所示。

四、酶的多形性与同工酶

1975年H.Harris提出酶的多形性概念，认为有很多酶催化相同的反应，但其结构和物理化学性质有所不同，这种现象称为酶的多形性。根据其来源可分为异源同工酶和同工酶（isoenzyme）。前者是不同来源的同工酶，例如，酵母菌中醇脱氢酶和动物肝脏中的醇脱氢酶。而后者是指来自同一生物体同一细胞的酶，能催化同一反应，但由于结构基因不同，因而酶的一级结构、酶的物理化学性质以及其他性质有所差别的一类酶，称为同工酶。测定同工酶最常用的方法是电泳法，此法对样品纯度要求不严格，分辨力强，而且简便快速。

例如，乳酸脱氢酶有5种同工酶：LDH₁、LDH₂、LDH₃、LDH₄和LDH₅，天冬氨酸激酶（AK）有三种同工酶：AK₁、AK₂和AK₃，磷酸葡萄糖变位酶有50种以上的同工酶。

五、寡聚酶（oligomeric enzyme）

由2～10个亚基组成的酶称为寡聚酶。其所含亚基可以是相同的，也可是不同的。绝大部分寡聚酶都含有偶数亚基，而且一般以对称形式排列，极个别的寡聚酶含奇数亚基。亚基是蛋白质分子中的最小单位。亚基与亚基之间一般以非共价键结合，彼此易于分开。寡聚酶分子质量一般高于30000u。如Cu Zn-超氧化物歧化酶分子质量约为32000u，它由两个亚基组成。又如酵母醛缩酶、碱性磷酸酶、大肠杆菌、酵母菌中的己糖激酶、醇脱氢酶等则由4个相同亚基组成。

上述寡聚酶其功能表现为多催化部位和可调节性。前者称为多催化部位酶（multisite enzyme），即每个亚基上都有一个催化部位，但无调节部位。一个底物与酶的一个亚基结合，而对其他亚基与底物结合无关。但当一个酶任何一亚基游离后，此酶则无活性。一个多催化部位的酶并不是多个分子的聚合体，而仅仅是一个功能分子。此类酶的动力学属双曲线型动力学，而后者为可调节酶（regulatory enzyme）。此类酶主要指别构酶（allosteric enzyme）和共价调节酶（covalently modulated enzyme）。例如，3-磷酸甘油醛脱氢酶，它是由4个相同亚基组成，是一个具有负协同效应的别构酶。此外，含异种亚基的寡聚酶，例如，大肠杆菌（E.coli）天冬氨酸转氨甲酰酶含有6条C链、6条R链，共12条肽链组成，组成2个催化亚基（C₃）和3个调节亚基上有别构效应剂CTP、ATP的结合部位，无催化活性而起着别构调节作用。

以亚基单位组成的寡聚酶一般属胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。相当数量的寡聚酶属调节酶，其活力可受各种形式的控制调节，在代谢过程中起着重要作用。

六、多酶复合体（multienzyme complex）

多酶复合体是由两个或两个以上的酶，在生活细胞某一部位靠非共价键连接而成一连串酶催化反应系统。其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次连接构成一个代谢途径或代谢途径中的一部分。其反应效率特别高，促进生物体的新陈代谢。例如，大肠杆菌丙酮酸脱氢复合体，是由三种酶组成：①丙酮酸脱氢酶（E1），它是以二聚体存在，分子质量为2×96000u；②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2），其分子质量为70000u；③二氢硫辛酸脱氢酶（E3），它是由二聚体组成，其分子质量为2×56000u。E1和E3所属的肽链规则地排列在内核周围，而E2的肽链组成复合体的内核。复合体直径约为30nm。上述三种酶组成大肠杆菌丙酮酸脱氢酶的多酶复合体。

大肠杆菌色氨酸合成酶复合体也是几种酶组成的，反应链在代谢过程起连续催化作用。催化这种链反应的几个酶往往组成一个多酶系统（multienzyme system）。有的多酶系统结构化程度很高，有的多酶系统在亚细胞结构上有严格的定位，承担着细胞内许多代谢途径的重要反应。

七、杂合酶（hybrid enzyme）

鉴于现有酶在相应的工业条件下其稳定性不佳，即使采用工程菌生产酶时，也会遇到变性的包含体以及对蛋白酶敏感等问题。由于蛋白质工程技术的发展，利用自然界进化的各种多样酶的性质及自然界用于进化酶的各种策略，有关杂合酶的研究日益受到重视。

杂合酶是由两种以上酶所组成的，把不同酶分子的结构单元或整个酶分子进行组合或交换，从而构建成具有特殊性质的酶杂合体。

1985年R.P.Wharton等将434个阻抑蛋白质识别DNA的α-螺旋外表面上的氨基酸，用P₂₂阻抑蛋白质的结合专一性，经体内体外测定均为P₂₂阻抑蛋白质的专一性。1986年P.T.Jone等用鼠抗体B_1-8重链可变区的CDR代替人骨髓瘤蛋白的相应CDR，新抗体则具有B_1-8的抗原亲和性（K_NP-cap=1.2μm），说明抗体间CDR的交换可以转移抗原识别专一性。

目前，杂合酶技术包括非理性设计和理性设计。前者无需事先了解酶的空间结构和催化机制。简便、快速、耗资低等优点，能较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导应用提供依据。1998年美国有14个杂合酶获得了专利。后者则要求对操作对象的结构与功能关系要有详细了解，才能实现结构元件从一个蛋白质转移至另一个蛋白质，从而产生新的性能杂合体。

杂合酶的应用主要包括：①改变酶的非催化性，获得杂合酶的特性值介于双亲酶特性值之间。例如，根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）β-葡萄糖苷酶（最适pH7.2～7.4、60℃）与纤维弧菌（Cellvibrio gilvas）β-葡萄糖苷酶（最佳活力在pH6.2～6.4，35℃），两者杂合所获得杂合酶的最佳活力在pH6.6～7.0，温度为45～50℃，并且对各种多糖的K_m介于双亲酶之间。②创造新催化活性酶，可以调整现有酶的特异性，向结合蛋白引入催化残基。例如，谷胱甘肽还原酶和硫辛酰胺脱氢酶的辅酶的结合位点进行残基交换，成功地获得了辅因子，优先从NADP转为NAD和从NAD转为NADP的新酶。③功能性结构域的交换。例如，把Ⅱ型DNA限制性内切酶FOK-Ⅰ的切割结构域同果蝇Ubx的DNA结合骨架和锌蛋白融合，构建了一个杂合酶FOK-Ⅰ，它可以和DNA靶序列结合并切割DNA。④杂合酶技术可应用于产生双功能或多功能蛋白质。例如，张先恩领导的研究小组通过一个连接肽编码序列将糖化酶（GA）基因的5′-末端融合到葡萄糖氧化酶（GOD）基因的3′-末端，从而构建了一个融合基因。将融合基因克隆表达后，得到一个分子质量为430ku杂合酶（GLG），它比来自酵母的GA和GOD的简单混合显示出更强的顺序催化性能。杂合酶技术的产生和发展，将为酶工程技术的研究和应用提供科学依据。