三、层析技术

层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相；另一是流动相。当待分离的混合物随溶液（流动相）通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶液向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用越小，向前移动的速度越快。反之，与固定相相互作用越强的组分，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单组组分，从而达到将各组分分离的目的。

层析系统的必要组分有：

（1）固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等，也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。

（2）层析床 把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。

（3）流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。起溶剂作用的液体或气体，用于协助样品平铺在固定相表面及将其从层析床中洗脱下来。

（4）运送系统 用来促使流动相通过层析床。

（5）检测系统 用于检测试管中的物质。

（一）层析的概念

1.分配系数及迁移率

分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析分离纯化物质的主要依据。

式中 c_s——固定相中的浓度；

c_m——流动相中的浓度。

迁移率（或比移值）是指在一定条件下，在相同时间内某一组分在固定相中移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用R_t来表示。

实验中还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于等于1，通常用R_x来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。

分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相与流动相的性质；③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式：

式中 K——分配系数（或平衡系数）；

ΔG0——标准自由能变化；

R——气体常数；

T——绝对温度。

上式是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的ΔG0为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20℃，K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。

2.分辨率（或分离度）

分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度，通常用R_s来表示。

式中 V_R1——组分1从进样点到对应洗脱峰值之间的洗脱液的总体积；

V_R2——组分2从进样点到对应洗脱峰值之间的洗脱液的总体积；

W₁——组分1的洗脱峰宽度；

W₂——组分1的洗脱峰宽度；

Y——组分1和组分2洗脱峰值处洗脱液的总体积之差值。

由上式可见，R_s值越大，两种组分分离越好。当R_s=1时，两组分具有很好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当R_s=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两组成分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。

对于一个层析柱来说，可作如下基本假设：

（1）层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积，称为板体积，以V_m表示。

（2）每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子的纵向扩散。

（3）溶质在各塔板之上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。

（4）流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。从一个塔板到另一个塔板流动体积为V_m。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳跃的次数为：n=。

（5）溶质开始加在层析柱的第零塔板上。

为了提高分辨率R_s的值，可采用以下方法：

（1）使理论塔板数N增大，则R_s上升。

①增加柱长，N可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗衣液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的方法。

②减小理论塔板的高度，如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱（HPLC）就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定颗粒直径为100μm；而HPLC柱子的固定相颗粒为10μm以下，且压力可达14700kPa（150kg/cm2），它使R_s大大提高，也使分离的效率大大提高了。

③采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或者太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于气相色谱，流速影响相当大。

（2）改变容量因子D（固定相与流动相中溶质量的分布比）。一般是加大D，但D的数值通常不超过10，再大对于提高R_s不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D限制在范围1＜D＜10，最佳范围1.5～5之间。可以通过改变柱温（一般降低温度）来改变流动相的性质及组成（如改变pH、离子强度、盐浓度、有机溶剂比例等），或改变固定相体积与流动相体积之比（如用细颗粒固定相，填充得紧密与均匀些），提高D值，使分离度增大。

（3）增大α（分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D之比），使R_s变大。实际上，使α增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使α发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，α的变化对R_s影响最明显。

总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性、活性等问题，如pH、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。

3.正相色谱与反相色谱

正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出来。

反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动速度快而先从柱中流出。

一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。

4.操作容量（或交换容量）

在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。它的单位是mmol（或mg）/g（基质）或mmol（或mg）/mL（基质），数值越大，表明基质对该物质的亲和力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析办法不能得到有效的分离。

（二）层析法的分类

层析根据不同的标准可以分为多种类型：

（1）根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等通常都采用柱层析形式。

（2）根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要汽化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。

（3）根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高的分辨率。

（三）常见的几种层析方法

1.纸层析（paper chromatography，PC）

纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维和水有较强的亲和力，能吸收22%左右的水，而且其中6%～7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般条件下较难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以一般的纸层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。纸层析对混合物进行分离时，发生两种作用：第一种是溶质结合纤维上的水与流过滤纸的有机相进行分配（即液-液分离）；第二种是根据滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固-液分配）。混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果。

在实际操作中，点样后的滤纸一端浸没于流动相液面之下，由于毛细作用，有机相即流动相开始从滤纸的一端向另一端渗透扩展。当流动相（有机相）沿滤纸经点样处时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行分配，一部分样品离开原点随流动相移动，进入无溶质区，此时又重新分配，一部分溶质由流动相进入固定相（水相）。随着流动相的不断移动，因样品中各种不同的溶质组分有不同的分配系数，移动速率也不一样，所以各种不同的部分按其各自的分配系数不断进行分配，并沿着流动相流动的方向移动，从而使样品中各组分得到分离和纯化。

可以用相对迁移率（R_f）来表示一种物质的迁移：

在滤纸、溶剂、温度等各项实验条件恒定的情况下，各物质的R_f值是不变的，它不随溶剂移动距离的改变而变化。R_f与分配系数K的关系：R_f=1/（1+AK）

A是由滤纸性质决定的一个常数。由此可见，K值越大，溶质分配于固定相的趋势越大，R_f值越小；反之，K值越小，分配于流动相的趋势越大，R_f值越大。R_f值是定性分析的重要指标。

在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的R_f比较接近，不易明显分离时，可采用双向纸层析法。该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方向展层以后，予以干燥，再旋转90°，在另一溶剂系统中进行展层，待溶剂到达所要求的距离后，取出滤纸，干燥显色，从而获得双向层析谱。应用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分开，而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开，就大大提高了分离效果。纸层析还可以与区带电泳法结合，能获得更有效的分离，这种方法称为指纹谱法。

2.薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）

薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂向上流动，从而使各组分得到分离的物理方法。常用的支持剂有：硅胶G、硅胶GF、氧化铝、纤维素、硅藻土、硅胶G硅藻土、纤维素G、DEAE-纤维素、交联葡聚糖凝胶等。使用的支持剂种类不同，其分离原理也不尽相同，有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等多种。图2-7所示为TLC系统组成。

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子和固体内部分子所受的吸引力不同。在固体内部，分子之间互相作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

薄层层析设备简单，操作简单，快速灵敏。改变薄层厚度，既能做分析鉴定，又能做少量制备。配合薄层扫描仪，可以同时做到定性定量分析，在生物化学、植物化学等领域是一类应用广泛的物质分离方法。

3.离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）

离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。该法可以同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点，是当前最常用的层析法之一，常用于多种离子型生物分子的分离，包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。

离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管中进行的。离子交换剂为人工合成的多聚物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。含有预被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争结合。任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。

离子交换剂是由基质、荷电基团和反离子构成，在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。

离子交换层剂与水溶液中离子或离子化合物所进行的离子交换反应是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的交换反应：RA+B+↔RB+A+；该反应能以极快的速度达到平衡，平衡的移动遵循质量作用定律。

溶液中的离子与交换剂上的离子进行交换，一般来说，电性越强，越易交换。对于阳离子树脂，在常温常压的稀溶液中，交换量随交换剂离子的电价增大而增大，如Na+＜Ca2+＜Al3+＜Si4+。如原子价数相同，交换量则随交换离子的原子序数的增大而增大，如Li+＜Na+＜K+＜Pb+。在稀溶液中，强碱性树脂各负电性基团的离子结合力次序是：CH₃COO-＜F-＜OH-＜HCOO-＜Cl-＜SCN-＜Br-＜＜NO2-＜I-＜＜＜柠檬酸根。弱酸性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的次序为：F-＜Cl-＜Br-=I-=CH₃COO-＜＜＜＜＜酒石酸根＜柠檬酸根＜＜＜OH-。两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和特定的条件呈现的离子状态：当pH＜pI时，能被阳离子交换剂吸附；反之，当pH＞pI时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pI条件下，且pI＞pH时，pI越高，碱性就越强，就越容易被阳离子交换剂吸附。

选择离子交换剂的一般原则：

（1）选择阴离子抑或阳离子交换剂，决定于被分离物质所带的电荷性质。如果被分离物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴离子交换剂；如被分离物为两性离子，则一般应根据其在稳定pH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。

（2）强型离子交换剂使用的pH范围很广，所以常用它来制备去离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。

（3）离子交换剂处于电中性时常带有一定的反离子，使用时选择何种离子交换剂，取决于交换剂对各种反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强酸型和强碱型离子交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸型和弱碱型交换剂应分别选择Na型和Cl型。

（4）交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。

主要操作要点：①交换剂的预处理、再生与转型；②交换剂装柱；③样品上柱、洗脱和收集。

4.凝胶层析法（gel chromatography，GC）

凝胶层析法也称分子筛层析法，是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。如果两种以上不同相对分子质量的分子都能进入凝胶颗粒网孔，但由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此也可以分离开来，如图2-8所示。

5.高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）

高效液相色谱是一种多用途的层析方法，可以使用多种固定相和流动相，并可以根据特定类型分子的大小、极性、可溶性或吸收特性的不同将其分离开来。高效液相色谱仪一般由溶剂槽、高压泵（有一元、二元、四元等多种类型）、色谱柱、进样器（手动或自动）、检测器（常见的有紫外检测器、折光检测器、荧光检测器等）、数据处理机或色谱工作站等组成。

其核心部件是耐高压的色谱柱。HPLC柱通常由不锈钢制成，并且所有的组成元件、阀门等都是用可耐高压的材料制成。溶剂运送系统的选择取决于：①等度（无梯度）分离：在整个分析过程中只使用一种溶剂（或混合溶剂）；②梯度洗脱分离：使用一种微处理机控制的梯度程序来改变流动相的组分，该程序可通过混合适量的两种不同物质来产生所需要的梯度。

由于HPLC的高速、灵敏和多用途等优点，它成为许多生物小分子分离所选择的方法，常用的是反相分配层析法。大分子物质（尤其是蛋白质和核酸）的分离通常需要一种“生物适合性”的系统如Pharmacia FPLC系统。在这类层析中用钛、玻璃或氟化塑料代替不锈钢组件，并且使用较低的压力以避免其生物活性的丧失。这类分离用离子交换层析、凝胶渗透层析或疏水层析等方法来完成。

HPLC的类型主要有以下几种：

（1）液-固吸附层析 固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂调节试样组分的滞留时间长短，并对试样中某几个组分具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正乙烷、环己烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。

（2）液-液分配层析 固定相由单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化，使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。

化学键合层析分为：①极性键合相层析。固定相为极性基团，分氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组分先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。②非极性键合相层析。固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用，还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组分先出峰，极性小的组分后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。

离子对分配层析分为：①正相离子对层析。此法常以水吸附在硅胶上作为固定相，把与分离组分带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中，待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对，在水相和有机相中进行分配，而达到分离。本法优点是流动相选择余地大，缺点是固定相易流失。②反向离子对层析。固定相是疏水性键合硅胶，如C18键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题，流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。

（3）离子交换层析 原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH最好在被分离酸、碱的pK值附近。

6.气相色谱（gas chromatography，GC）

现代的气相色谱使用长达50m的毛细管层析柱（内径为0.1～0.5mm）。固定相通常为一种交联的硅多体，附着在毛细管内壁成一层膜。在正常操作温度下，其性质类似于液体膜，但要结实得多。流动相（载气）通常为氮气或氢气。依据不同组分在载气与硅多体相之间的分配能力不同达到选择性分离的目的。大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在分析过程中维持恒定（等温——通常为50～250℃），更常见的为设定一个增温的程序（如以每分钟10℃的速度从50℃升高到250℃）。样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。柱中的产物可用下列方法检测出：

（1）火焰离子检测法 流出气体通过一种可使任何有机复合物离子化的火焰，然后被一个固定在火焰顶部附近的电极所检测。

（2）电子捕获法 使用一种发射β-射线的放射性同位素作为离子化的方式。这种方法可以检测极微量（pmol）的亲电复合物。

（3）分光光度计法 包括质谱分析法（GC-MS）和远红外光谱分析法（GC-IR）。

7.亲和层析

亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一个能与载体共价结合，一个能与被亲和分子结合。配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法等四类方法。常用的配位体如下：

（1）三嗪染色剂，用于蛋白质的纯化。

（2）酶的底物或偶联因子，用于特定酶的纯化。

（3）抗体，用于相应的抗原。

（4）蛋白质A，用于IgG抗体的纯化。

（5）单链寡核苷酸，用于互补的核酸如mRNA，或特定的单链DNA序列。

（6）凝集素，用于特定的单糖亚基。

亲和层析的基本操作如下：

（1）寻找能被分离分子（称配体）识别和可逆结合的专一性物质——配基。

（2）把配基共价结合到层析介质（载体）上，即把配基固定化。

（3）把载体-配基复合物灌装在层析柱内做成亲和柱。

（4）上样亲和→洗涤杂质→洗脱收集亲和分子（配体）→亲和柱再生。

8.聚焦层析

聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的原理是根据各种蛋白质的等电点不同来进行分离的过程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡，然后用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液pH呈梯度下降。

聚焦层析所用凝胶主要有两种：MONOP和多元缓冲液交换剂（PBE）。其中MONOP是带孔小珠，孔中被带正电荷的胺基填充，适用于高效聚焦层析。多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶，适于作普通聚焦层析的介质。各种凝胶性质见表2-2。