四、电泳技术

电泳技术，是指在电场作用下，带电颗粒由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。

许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构及所在介质的pH和组成。由于混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。

电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12～14cm，厚度为1～2mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物带电性质的稳定。

为了更好地了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。

在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积：

F =q·E

式中 q——带电分子的静电荷；

E——电场强度。

这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质黏滞力的阻碍。黏滞力（F′）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液黏度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F的大小服从Stokes定律，即：

F′=6πrηυ

式中 r——球状分子的半径；

η——缓冲液黏度；

υ——电泳速度（υ=，单位时间粒子运动的距离，cm/s）。

当带电分子匀速移动时：

F =F′，即q·E =6πrηυ

由上式可知，相同带电颗粒在不同强度的电场里泳动速度是不同的。为了便于比较，常用迁移率代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率为带电粒子在单位电场强度下的泳动速度。若以m表示迁移率，上式两边同时除以电场强度E，则得：

这就是迁移率公式，由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的黏度呈反比。

用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，实际使用的是相对迁移率m。即：

式中 d——带电粒子泳动的距离；

t——电泳的时间；

V——电压；

L——两电极交界面之间的距离，即凝胶的有效长度。

因此，相对迁移率m，就是两种带电粒子在凝胶中泳动迁移的距离比。

带电分子由于各自的电荷和形状、大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，则它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通过放射性自显影等方法进行检测。

（一）影响电泳的主要因素

由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，下面简单讨论一些主要的影响因素。

1.待分离生物大分子的性质

待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。

2.缓冲液的性质

缓冲液的pH会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH距离其等电点越远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02～0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的黏度也会对电泳速度产生影响。

3.电场强度

电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为：

W=I 2 Rt

式中 I——电流强度；

R——电阻；

t——电泳时间。

电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质黏度降低、电阻下降等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分黏度下降，摩擦因数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓形。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当降低温度以获得较好的分离效果。

4.电渗

液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si—OH基团等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。

5.支持介质的筛孔

支持介质的筛孔大小对分离生物大分子的电泳迁移速度有明显影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。

综上所述，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液黏度、温度、pH、电渗及离子强度等多种因素的影响。当电泳结果欠佳时，应检查或重新设计实验条件以便改进。

（二）电泳方法的分类

1.按支持物的物理性状不同分类

按支持物的物理性状，区带电泳可分为：

（1）滤纸及其他纤维（如醋酸纤维、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电位；

（2）粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳；

（3）凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等电泳；

（4）丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。

2.按支持物的装置形式不同分类

按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：

（1）平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式；

（2）垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳；

（3）垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类；

（4）连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。后来有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸来分离血清蛋白质的，分离量最大。

3.按pH的连续性不同分类

按pH的连续性不同，区带电泳可分为：

（1）连续pH电泳，即在整个电泳过程中pH保持不变，常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等属于此类；

（2）非连续性pH电泳，缓冲液和电泳支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白质时常用这种形式。它的优点是易在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速并压缩为一极狭窄的区带而达到浓缩的作用。

（三）电泳技术的应用

电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于分析某种物质纯度，还可用于相对分子质量的测定。电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”就是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，提高了对蛋白质的鉴定能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶，对于酶的催化和调节功能有了深入的了解。所以电泳技术是医学科学中的重要研究技术。

1.纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳

纸电泳用于血清蛋白质分离已有相当长的历史，在实验室和临床检验中都曾得到广泛应用。自从1957年Kohn首先将醋酸纤维薄膜用作电泳支持物以来，纸电泳已被醋酸纤维薄膜电泳所取代。因为后者具有比纸电泳电渗小、分离速率快、分离清晰、血清用量少以及操作简单等优点。

纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差，但由于其操作简单，所以仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。

纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH2.0～3.5的酸性缓冲液，分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀，常用国产新华滤纸和进口的Whatman I号滤纸。点样位置是在滤纸的一端距纸边5～10cm处。样品可点成圆形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为5～100μg和5～10μL。点样方法有干点法和湿点法。湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲液浸湿，样品液要求较浓，不要多次点样。干点法是在点样后用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因此可以用较稀的样品。电泳时要选择好正、负极，电压通常使用2～10V/cm的高压电泳，电泳时间可以大大缩短，但必须解决电泳时的冷却问题，并要注意安全。

电泳完毕记下滤纸的有效使用长度，然后烘干，用显色剂显色，显色剂和显色方法，可查阅有关书籍。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。

醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似，只是换了醋酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1～0.15mm。

醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比有以下优点：①醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰。②快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性比滤纸小，吸水少，电渗作用小，电泳时大部分电流由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，完成全部电泳操作只需90min左右。③灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，点样量甚至少到0.1μL，仅含5μg的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。④应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。⑤醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。

由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。

2.琼脂糖凝胶电泳

琼脂经处理去除其中的果胶成分即为琼脂糖。由于琼脂糖中硫酸根含量较琼脂为少，电渗影响减弱，因而使分离效果显著提高。例如，血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳只能分出两条区带（α-脂蛋白、β-脂蛋白），而琼脂糖凝胶电泳可将血清脂蛋白分出三条区带（α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白）。所以琼脂糖是一种较理想的凝胶电泳材料。

琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%～3%，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度地取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。DNA分子的电泳迁移率与其相对分子质量的常用对数成反比（切记：不是线性的关系）；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。为了方便在电泳图中迅速读出待测定DNA片段的大小，在电泳过程中往往加入固定片段大小的DNA marker作为参照物。另外，一些低熔点的琼脂糖（62～65℃）可以在65℃时融化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。

3.聚丙烯酰氨凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）

聚丙烯酰氨凝胶电泳是以聚丙烯酰氨凝胶作为支持介质。聚丙烯酰氨凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH₂═CHCONH₂，acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺［CH₂（NHCOHC═CH₂）₂N，N-mechylene bisacrylamide］聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成，通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED）引发自由基聚合反应：

以R*代表自由基，M*代表丙烯酰胺单体，则聚合过程可以表示为：

R*+M—→RM*

RM*+M—→RMM*

RMM*+M—→RMMM*…

这样，由于乙烯基“CH₂═CH—”一个接一个地聚合，就形成了丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。

聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3%～30%之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的相对分子质量进行分离的电泳中，如10%～20%的凝胶常用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。

未加SDS的天然阳离子聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～100μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例，聚合成不同孔径大小的凝胶，可以用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基的相对分子质量。

4.免疫电泳技术

免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此做更细微的分析。免疫电泳为区带电泳与免疫双向扩散的结合，先利用区带电泳技术将不同电荷和相对分子质量的蛋白抗原在琼脂内分离开，然后与电泳方向平行在两侧开槽，加入抗血清。置室温或37℃下使两者扩散，各区带蛋白在相应位置与抗体反应形成弧形沉淀线。根据各蛋白所处的电泳位置，可以精确地将不同的蛋白加以分离鉴别。

5.毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）

毛细管电泳又称高效毛细管电泳（HPCE），是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在内径75微米的毛细管柱内用高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦，Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988-1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内，由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质（包括酶、抗体）、核苷酸乃至脱氧核糖核酸（DNA）的分离分析要求，所以得到了迅速的发展。CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。

CE和高效液相色谱法（HPLC）相比，其相同处在于都是高效分离技术，仪器操作均可自动化，且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，CE的分析时间通常不超过30min，比HPLC速度快；对CE而言，从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比，对扩散系数小的生物大分子而言，其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nL级，最低可达270fL，流动相用量也只需几毫升，而HPLC所需样品为 μL级，流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量制备。

CE和普通电泳相比，由于其采用高电场，因此分离速度要快得多；检测器除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外，其他类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差，而CE定量精度较好；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。总之，CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度，常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol，激光诱导荧光检测器达10-19～10-21mol；高分辨率，其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至千万，而HPLC一般为几千到几万；高速度，最快可在60s内完成，在250s内分离10种蛋白质，1.7min分离19种阳离子，3min内分离30种阴离子；样品少，只需nL（10-9L）级的进样量；成本低，只需少量（几毫升）流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力，使CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然CE还是一种正在发展中的技术，有些理论研究和实际应用正在进行与开发。

CE现有6种分离模式，分别如下：

（1）毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE），又称毛细管自由电泳，是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。

（2）胶束电动毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC），是把一些离子型表面活性剂（如十二烷基硫酸钠，SDS）加到缓冲液中，当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电，但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度，故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相（准固定相）之间产生分配，中性粒子因其本身疏水性不同，在二相中分配就有差异，疏水性强的胶束结合牢固，流出时间长，最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使CE能用于中性物质的分离，拓宽了CE的应用范围，是对CE极大的贡献。

（3）毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis，CGE），是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，溶质按分子大小逐一分离。凝胶黏度大，能减少溶质的扩散，所得峰形尖锐，能达到CE中最高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱，可分离、测定蛋白质和DNA的相对分子质量或碱基数，但其制备麻烦，使用寿命短。如采用黏度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺，可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分（non-gel sieving）介质。它能避免空泡形成，比凝胶柱制备简单，寿命长，但分离能力比凝胶柱略差。CGE和无胶筛分正在发展成第二代DNA序列测定仪，将在人类基因组织计划中起重要作用。

（4）毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF），是将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。通过管壁涂层使电渗流减到最小，以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带，再将样品与两性电解质混合进样，两端贮瓶分别为酸和碱。加高压（6～8kV）3～5min后，毛细管内部建立pH梯度，蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦，形成明显的区带。最后改变检测器末端贮瓶内的pH，使聚焦的蛋白质依次通过检测器而得以确认。

（5）毛细管等速电泳（capillary isotachor-phoresis，CITP），是一种较早的模式，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离，常用于分离离子型物质，目前应用不多。

（6）毛细管电色谱（capillary electrochromatography，CEC），是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所下降，但增加了选择性。此法有发展前景。

毛细管电泳（CE）除了比其他色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前三个部件均易实现，困难之处在于检测器，特别是光学类检测器，由于毛细管电泳溶质区带的超小体积的特性导致光程太短，而且圆柱形毛细管作为光学表面也不够理想，因此对检测器灵敏度要求相当高。

当然在CE中也有利于检测的因素，如在HPLC中，因稀释之故，溶质到达检测器的浓度一般是其进样端原始浓度的1%，但在CE中，经优化实验条件后，可使溶质区带到达检测器时的浓度和在进样端开始分离前的浓度相同。而且CE中还可以采用堆积等技术使样品达到柱上浓缩效果，使初始进样体积浓缩为原来体积的1%～10%，这对检测十分有利。因此从检测灵敏度的角度来说，HPLC具有良好的浓度灵敏度，而CE提供了很好的质量灵敏度。

下面介绍几种常用的凝胶电泳。

1.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳

将丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、缓冲液和催化剂等溶液按一定比例加到用琼脂封了底的玻璃管中，聚合后得到圆柱胶。圆柱胶面之上加上待分离的样品，注入直流电源电路中，经过一定时间的电泳，样品中各组分在圆柱胶中分离，分离在不同层次上。电泳结束后将胶条剥出，进行染色、褪色处理，从胶条侧面可见到一个一个的组分条带，与多个圆盘叠加在一起相似，故将在柱胶中进行的电泳分离技术称为聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。

实际操作时，在玻璃管中分两次灌胶。先灌下层的分离胶，待其聚合后再灌上层的浓缩胶。这样制得的凝胶柱实际上是个不连续体系。利用该体系中凝胶柱孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性，使进入柱胶的样品在浓缩胶中逐渐浓缩、在上下胶层界面上最终被压缩成很薄的样品区带，进入分离胶后进行组分的分离，形成最终的分离区带。根据分离胶缓冲液pH高低，有3种操作系统，分别为碱性系统、酸性系统和中性系统，其中以碱性系统最为常见。

在浓缩胶中，除了有电荷效应和分子筛效应外，还存在一种特殊的浓缩效应。该效应是以上多种不连续效应综合作用的效果。这种不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳由于兼有电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，因此具有很高的分辨率。其分子筛效应主要由凝胶孔径大小决定，而决定凝胶孔径大小的主要是凝胶的浓度。但交联剂对电泳泳动率也有影响，交联剂质量对总单位质量的百分比越大，则电泳泳动率越小。不管交联剂是以何种方式影响电泳时的泳动率，总之它是影响凝胶孔径的一个重要参数。为了使实验重复性提高，在制备凝胶时对交联剂的浓度、交联剂与丙烯酰胺的比例、催化剂的浓度、聚胶所需的时间等影响泳动率的因子都尽可能保持恒定。

2.连续密度梯度电泳

如果合成的聚丙烯酰胺凝胶从上至下是一个正的线性梯度凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐减小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力越来越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速率主要受两个因素的影响：一是样品本身的电荷密度，电荷密度越高，迁移速率越快；二是样品分子的大小，相对分子质量M_r越大，迁移速率越慢。当迁移所受到的阻力达到足以使样品分子完全停止前进时，那些跑得慢的低电荷密度的样品分子将“赶上”与它大小相同但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。因此，在梯度凝胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于分子自身的大小，而与样品分子的电荷密度无关。样品混合物中相对分子质量大小不同的组分，电泳后将依相对分子质量大小停留在不同的凝胶孔径层次中形成相应的区带。由此看出，在梯度凝胶电泳中，分子筛效应体现得更为突出。由于相对迁移率与相对分子质量的对数在一定范围内呈线性关系，故可以用来测定蛋白质的相对分子质量，但仅适合于球状蛋白质，且电泳要有足够高的伏特小时（一般不低于2000V·h）。

连续密度梯度电泳具有以下优点：

（1）具有使样品中各个组分浓缩的作用。稀释的样品可以分次上样，不会影响最终分离效果。

（2）可提供更清晰的谱带，适于纯度分析。

（3）可在一张胶片上同时测定相对分子质量分布范围相当大的多种蛋白质的相对分子质量。

（4）可以测定天然状态蛋白质的相对分子质量，这对研究寡聚蛋白是相当有用的。

3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的静电荷的多少、分子的大小和形状。如果用还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，并且1g蛋白质可定量结合1.4g SDS，亚基的构象呈长椭圆棒形。由于与蛋白质结合的SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量负电荷，其数值大小超过蛋白质原有的电荷密度，掩盖了不同亚基间原有的电荷差异。各种蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，电泳时纯粹按亚基靠凝胶分子筛效应进行分离。有效迁移率与相对分子质量的对数呈很好的线性关系。所以，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅是一种很好的蛋白质分离的方法，也是一种十分有用的测定蛋白质相对分子质量的方法。应该注意的是，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得的是蛋白质亚基的相对分子质量。对寡聚蛋白来说，为了正确反映其完整的分子结构，还应用连续密度梯度电泳或凝胶过滤等方法测定天然构象状态下的相对分子质量及分子中肽链（亚基）的数目。

4.等电聚焦电泳

聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成的两性电解质载体，在电场的作用下会自发形成一个连续的pH梯度。蛋白质样品在电泳中被分离，运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点的差异，并不利于凝胶的分子筛作用。它的分辨率高，可分离等电点相差0.01～0.02pH单位的蛋白质，可用来准确测定蛋白质的等电点，精确度可达0.01pH单位。

等电聚焦多采用水平平板电泳，也可使用管式电泳。由于两性电解质的价格昂贵，使用1～2mm厚的凝胶进行等电聚焦价格较高。使用两条很薄的胶带作为玻璃板间隔，可以形成厚度仅0.05mm的薄层凝胶，大大降低了成本，所以等电聚焦通常使用这种薄层凝胶。由于等电聚焦过程需要蛋白质根据其电荷性质在电场自由迁徙，通常使用较低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（如4%）以防止分子筛作用，也经常使用琼脂糖，尤其对于相对分子质量较大的蛋白质，制作等电聚焦薄层凝胶时，首先将两性电解质、核黄素与丙烯酰胺贮液混合，加入到带有间隔胶条的玻璃板上，而后在上面加上另一块玻璃板，形成平板薄层凝胶。经过光照聚合后，将一块玻璃板撬开移去，将一小薄片湿滤纸分别置于凝胶两侧，连接凝胶和电解液（阳极为酸性如磷酸溶液，阴极为碱性如氢氧化钠溶液）。接通电源，两性电解质中不同等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH梯度，从阳极侧到阴极侧pH由低到高呈线性梯度分布。而后关闭电源，上样时取一小块滤纸吸附样品后放置在凝胶上，通电30min后样品通过电泳离开滤纸加入凝胶中，这时可以去掉滤纸。最初样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH，等电点在pH以上的蛋白质带正电，在电场的作用下向阴极移动，在迁移过程中，蛋白质所处的凝胶的pH逐渐升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，到达pH=pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷，停止迁移。同样，等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电，向阳极移动，最终到达pH=pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上什么位置，各种蛋白质都能向着其等电点处移动，并最终到达其等电点处，对最后的电泳结果没有影响。所以有时样品可以在制胶前直接加入到凝胶溶液中。使用较高的电压（如2000V，0.5mm平板凝胶）可以得到较快速的分离（0.5～1h），但应注意对凝胶的冷却以及使用恒定功率的电源。凝胶结束后对蛋白质进行染色时应注意，由于两性电解质也会被染色，使整个凝胶都被染色。所以等电聚焦的凝胶不能直接染色，要首先经过10%的三氯乙酸的浸泡以除去两性电解质后才能进行染色。

等电聚焦还可以用于测定某个未知蛋白质的等电点，将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pI在3.5～10.0之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的pI值作图，即得到标准曲线。而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。

等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋白质的微观不均一性，例如一种蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，而在等电聚焦中表现三条带，这可能是由于蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的相对分子质量产生明显的影响，因此在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等电聚焦中可以被分离检测到。同工酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。由于等电聚焦过程中蛋白质通常是处于天然状态的，所以可以通过前面介绍的活性染色的方法对酶进行检测。等电聚焦主要用于分离分析，但也可以用于纯化制备。虽然成本较高，但操作简单、纯化效率很高。

5.双向凝胶电泳

二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。由于蛋白质的等电点和相对分子质量之间没有什么必然的联系，因此经过双向电泳可将数千种蛋白质分开，显示出极高的分辨力。

这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。

通常第一维电泳是等电聚焦，在细管（Φ1～3mm）中加入含有两性电解质、8mol/L的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30min，使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其相对分子质量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和相对分子质量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000～2000个蛋白质，有些报道可以分辨出5000～10000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。例如，将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中，通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较，转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点，这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。

（四）电泳中蛋白质的检测、鉴定与回收

检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R-250（CBB，coomassiebrilliantblue），通常是用甲醇∶水∶冰醋酸（体积比为45∶45∶10）配制0.1%或0.25%（质量浓度）的考马斯亮蓝溶液作为染色液。这种酸-甲醇溶液使蛋白质变性，固定在凝胶中，防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散，通常染色需2h。脱色液是同样的酸-甲醇混合物，但不含染色剂，脱色通常需过夜摇晃进行。考马斯亮蓝染色具有很高的灵敏度，在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到1μg的蛋白质形成的染色带。考马斯亮蓝与某些纸介质结合非常紧密，所以不能用于染色滤纸、醋酸纤维素薄膜以及蛋白质印迹（在硝化纤维素纸上）。在这种情况下通常是用10%的三氯乙酸浸泡使蛋白质变性，而后使用染色能力不太强的染料如溴酚蓝、氨基黑等对蛋白质进行染色。

银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，它是通过银离子（Ag+）在蛋白质上被还原成金属银形成黑色来指示蛋白区带的。银染可以直接进行也可以在考马斯亮蓝染色后进行，这样凝胶主要的蛋白带可以通过考马斯亮蓝染色分辨，而细小的考马斯亮蓝染色检测不到的蛋白带由银染检测。银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测低于1ng的蛋白质。

糖蛋白通常使用过碘酸-Schiff试剂（PAS）染色，但PAS染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的红-粉红带，难以在凝胶中观察。目前更灵敏的方法是将凝胶印迹后（下面介绍）用凝集素检测糖蛋白。凝集素是从植物中提取的一类糖蛋白，它们能识别并选择性地结合特殊的糖，不同的凝集素可以结合不同的糖。将凝胶印迹用凝集素处理，再用连接辣根过氧化物酶的抗凝集素抗体处理，然后再加入过氧化物酶的底物，通过生成有颜色的产物就可以检测到凝集素结合情况。这样凝胶印迹用不同的凝集素检测不仅可以确定糖蛋白，而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。

通过扫描光密度仪对染色的凝胶进行扫描可以进行定量分析，确定样品中不同蛋白质的相对含量。扫描仪测定凝胶上不同迁移距离的吸光度值，各个染色的蛋白带形成对应的峰，峰面积的大小可以代表蛋白质含量的多少。另外一种简单的方法是将染色的蛋白带切下来，在一定体积的50%吡啶溶液中摇晃过夜溶解染料，而后通过分光光度计测定吸光度值，就可以估算蛋白质的含量。但应注意，蛋白质只有在一定的浓度范围内其含量才与吸光度值呈线性关系。另外不同的蛋白质即使在含量相同的情况下染色程度也可能有所不同，所以上面的方法对蛋白质含量的测定只是一种半定量的结果。

尽管凝胶电泳通常是作为一种分析工具使用，它也可以用于蛋白质的纯化制备。但电泳后需将蛋白质从凝胶中回收，通常是将所需的蛋白质区带部分的凝胶切下，通过电泳的方法将蛋白质从凝胶中洗脱下来（称为电洗脱）。目前有各种商品电洗脱池装置。最简单的方法是将切下的凝胶装入透析袋内加入缓冲液浸泡，再将透析袋浸入缓冲液中进行电泳，蛋白质就会向某个电极方向迁移而离开凝胶进入透析袋内的缓冲液。由于蛋白质不能通过透析袋，所以电泳后蛋白质就留在透析袋的缓冲液中。电洗脱后可通一个反向电流，持续几秒钟，使吸附在透析袋上的蛋白质进入缓冲液，这样就可以将凝胶中的蛋白质回收。

（五）蛋白质印迹

印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RN A和蛋白质进行印迹分析，对RN A的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法（图2-9），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片硝酸纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但这种方法转移的效率较低，通常只能转移凝胶中一小部分蛋白质（10%～20%）。电泳印迹可以更快速有效地进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。

转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其他蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗是鼠抗lgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定lgG的抗体可以直接购买，作为标记的二抗。最常用的一种是酶联的二抗，印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶联抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色产物；而辣根过氧化物酶可以以H₂O₂为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯酚萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H₂O₂存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在相片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。除了酶联二抗作为指示剂，也可以使用其他指示剂，主要包括以下一些：

I（碘-125）标记的二抗：可以通过放射性自显影检测。

荧光素异硫氰酸盐标记的二抗：可以通过在紫外灯下产生荧光来检测。

I（碘-125）标记金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）可以与IgG的Fc区特异性结合，因此，Protein A可以代替二抗。I标记的Protein A通过放射性自显影检测。

金标记的二抗：二抗通过微小的金颗粒包裹，与一抗结合时可以表现红色。

生物素结合的二抗：印迹用生物素结合的二抗处理后，再用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝集素紧密结合，这种方法实际上相当于通过生物素与凝集素的紧密结合将二抗与酶连接，通过酶的显色反应就可以进行检测。这种方法的优点是由于生物素是一个小分子蛋白，一个抗体上可以结合多个生物素，可以大大增强显色反应的信号。

除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其他探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA蛋白。