七、生物大分子的制备
（一）概述
生物大分子主要是指蛋白质、酶（也是一种蛋白质）和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题。而生物大分子的结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有足够纯度的生物大分子作为制备工作的前提，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作，有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的努力。
与生物产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：
（1）生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物，其中许多化合物至今还是个谜，有待人们研究与开发。有的生物大分子在分离过程中还在不断地代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想要找一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。
（2）许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一甚至百万分之一，分离纯化的步骤繁多，流程又长。有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。例如，由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几吨甚至几十吨的生物材料，才能提取几毫克的样品。
（3）许多大分子物质一旦离开了生物体内的环境就极易失活，因此分离过程中如何预防其失活，是生物大分子提取制备最困难之处。过碱、过酸、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶性都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。
（4）生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成分，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
由于生物大分子的分离和制备是如此地复杂和困难，因而实验方法和流程的设计就需要尽可能多查文献，多参照前人所做的工作，吸取其经验和精华，探索者的反复和失败是不可避免的，只有具有百折不挠的专研精神才能达到预期的目的。
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
（1）确定制备生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质；
（2）建立相应的可靠地分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”；
（3）通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质；
（4）生物材料的破碎和预处理；
（5）分离纯化方案的选择和探索，是最困难的过程；
（6）生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点或HPLC和毛细管电泳都是一个峰；
（7）产物的浓缩、干燥和保存。
分析测定的方法主要有两类：即生物学测定方法和物理、化学测定方法，生物学的测定法主要有酶的各种测活方法、蛋白质的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定方法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外、可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法以及核磁共振等。实际操作应尽可能多用仪器分析方法，使分析测定更加快速、简便。
生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法才能确定。蛋白质和酶制成品的鉴定最常用的方法是：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，如能再用高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）进行联合鉴定则更理想，必要时再做N-末端氨基酸残基的分析鉴定，过去曾用的溶解度法和高速离心沉降法，现在很少再用。核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但最方便的还是紫外吸收法，即测定样品在pH7.0时，260nm与280nm的吸光度（A260和A280），从
的比值即可判断核酸样品的纯度。
要了解的生物大分子的物理化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性；②在不同温度、pH和各种缓冲溶液中生物大分子的稳定性；③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性；④各种物理性质，如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶树脂等填料中的分配系数等；⑤其他化学性质，如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性；⑥对其他生物分子的特殊亲和力等。
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理基本可以归纳为两个方面：①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。由于生物大分子不能加热熔化和液化，因而所能分的物相只限于固相和液相，在此两相之间交替进行分离纯化。在实际工作中往往要综合运用多种方法，才能制备出高纯度的生物大分子。
纯化生物大分子总是希望纯度和产率都要高。例如，纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率都要高才好，但实际上两者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能地高，而牺牲一些回收率，在工业生产中则正相反。
（二）生物大分子制备的前处理
1.生物材料的选择
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源主要是动物、植物和微生物及其代谢产物。从工业生产角度选择材料应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料，但往往这几方面的要求不能同时具备，含量丰富但来源困难，或含量来源较理想，但材料的分离纯化方法烦琐、流程很长，反而不如目标物质含量低但易于获得纯品的材料。由此可见，必须根据具体情况，抓住主要矛盾决定取舍，从科研的角度取材，则只需考虑材料的选择符合实验预定的目标要求即可。除此之外，选材还需注意植物的季节性、地理位置和生长环境等。选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对较少，有利于生物大分子的分离和提取，选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。
材料选定后要尽可能地保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳除脂，微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需要深度冷冻保存。
2.细胞的破碎
除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并且不丧失其生物活性。不同的生物体或同一生物体不同部位的组织，其细胞破碎的难度不一，使用的方法也不同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有比较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
（1）机械法
①研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或用金刚砂研磨或匀浆，即可将动物组织破碎，这种方法比较温和，适合实验室使用。
②组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000～20000r/min的组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10～20s，停10～20s，可反复多次。
（2）物理法
①反复冻融法：将破碎的细胞冷至-15～-20℃，然后放于室温（或40℃）下迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余细胞的盐浓度增高而引起细胞的溶胀破碎。
②超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果跟样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防止过热。
③压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在（1000～2000）×105Pa的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎，这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。
④冷热交替法：从细胞或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法，在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大多数细胞可以被破碎。
（3）化学与生物化学方法
①自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白质酶和酯酶）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和细胞膜破坏，同时也可能会把某些要提取的有效成分分解了。
②溶胀发：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
③溶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8.0，处理15min，可以专一地将细胞壁分离，释放出细胞内含物。此法适用于多种微生物，例如，从某些细菌细胞提取质粒DNA时，可采用溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁；而在破酵母细胞时常采用蜗牛酶（来自蜗牛），将酵母细胞悬于0.1mmol/L柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液（pH5.4）中，加1%蜗牛酶，在30℃处理30min，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2%巯基乙醇效果会更好，此法可以与研磨法联合使用。
④有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破碎，此法也可以与研磨法联合使用，注意使用浓度不能太高，否则会造成蛋白质分子的失活。
（三）生物大分子的提取
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，并尽可能地保持原来的天然状态、不丢失生物活性的过程。这一过程是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分离，即由固相转入液相，或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。
影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；溶剂的pH和提取时间等。一种物质在某一溶剂中溶解度的大小与该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。一般地说，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大，远离等电点的pH，溶解度增加。提取时所选用的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。
1.水溶液提取
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：
（1）盐浓度（即离子浓度）离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白质复合物，在高离子浓度下溶解度增加，而另一些物质，如RNA-蛋白质复合物，在低离子强度下溶解度增加，在高离子强度下溶解度减小。绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间基因的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子之间的作用力的结果，所以低盐溶液常用于大多数生化物质的提取。通常使用0.02～0.05mol/L缓冲液或0.09～0.15mol/L NaCl溶液提取蛋白质和酶。不同的蛋白质极性大小不同，为了提高提取效率，有时需要提高或降低溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子浓度［如加入KCl、NaCl、NH4Cl或者（NH4）2SO4］可以增加溶液的极性。
（2）pH蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH有关。过酸、过碱都应该尽量避免，一般控制在6.0～8.0范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧，碱性蛋白质选在偏酸一侧，酸性蛋白选在偏碱一侧，以增加蛋白质的溶解度，提高提取效果。例如，胰蛋白酶微碱性蛋白质常用稀酸提取而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，则常用稀碱来提取。
（3）温度 为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0～5℃条件下操作。但少数对温度耐受力强的蛋白质和酶，可提高温度使杂蛋白变性，有利于提取和下一步的纯化。
（4）防止蛋白酶或核酸的降解作用 在提取蛋白质、酶和核酸时，常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而导致实验的失败。为防止这一现象的发生，常常采用抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用，例如在提取DNA时加入EDTA配位DNAase活化所必需的Mg2+。
（5）搅拌与氧化 搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增加了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基因，若提取液中有氧化剂或与空气中的氮气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活力的丧失，另外在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。
2.有机溶剂提取
一些脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸和稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。其中正丁醇在0℃时在水中的溶解度为10.5%，40℃时为6.6%，同时又具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。例如，植物种子中的玉米蛋白、麸蛋白，常用70%～80%的乙醇提取，动物组织中一些线粒体及微粒上的酶常用丁醇提取。
有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中。在这种情况下，采用稀的有机溶剂提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。例如，胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因此采用6.8%乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0，进行提取，这样就从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①6.8%的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca2+；③选用pH2.5～3.0，这是糜蛋白酶不宜作用的pH。以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，却可除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。
（四）生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分非常复杂，数千种乃至上万种生物大分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
1.沉淀法
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简单，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
沉淀法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生，是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法如下。
（1）中性盐沉淀（盐析法）多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
（2）有机溶剂沉淀 多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
（3）选择性变性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）多用于除去某些不耐热的和在一定pH下易变性的杂蛋白。
（4）等电点沉淀 用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
（5）有机聚合物沉淀 是发展较快的一种新方法，主要使用聚乙二醇（PEG）（poly ethyeneglycol）作为沉淀剂。
以上几种沉淀方法的基本原理、操作要点等如下。
（1）中性盐沉淀法 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广的是在蛋白质领域，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备；②操作简单、安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用。
①中性盐沉淀蛋白质的基本原理。蛋白质中的—COOH、—NH2和—OH都是亲水基团，这些基团与极性均易溶于水，与水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1～100nm的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体的稳定性，蛋白质分子即形成沉淀。
②中性盐的选择。最常用的中性盐是（NH4）2SO4，其具有十分突出的优点：a.溶解度大。尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要在低温下（0～4℃）进行。b.分离效果好。有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75%的杂蛋白，纯度提高了4倍。c.不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用，有的酶或蛋白质用2～3mol/L（NH4）2SO4保存可达数年之久。d.价格便宜，废液不污染环境。
③盐析的操作方法。最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢匀速少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或摩尔数，这是由于当固体硫酸铵加到溶液中时，会出现相当大的非线性体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，已确定出1L纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，使用时十分方便。
④盐析的影响因素。
a.蛋白质的浓度。中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用。比较适中的蛋白质浓度是2.5%～3.0%，相当于25～30mg/mL。b.pH对盐析的影响。蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH常选在该蛋白质的等电点附近。c.温度的影响。温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0～4℃下操作，以避免活力丧失。
（2）有机溶剂沉淀法
①基本原理。有机溶剂对许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走水分子，破坏蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
有机溶剂沉淀法的优点是：a.分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；b.沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋除去有机溶剂），因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
②有机溶剂的选择和浓度的计算。用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的溶剂是乙醇。进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：
式中 V——需加入100%浓度有机溶剂的体积；
V0——原溶液体积；
S1——原溶液中有机溶剂的浓度；
S2——所要达到的有机溶剂的浓度。
100是指加入的有机溶剂浓度为100%，如所加入的有机溶剂的浓度为95%，上式中的（100-S2）项应改为（95-S2）。上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数，如加入1倍、2倍、3倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
③有机溶剂沉淀的影响因素。
a.温度。多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的，大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。
b.样品浓度。样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用5～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。
c.pH。有机溶剂沉淀要选择在样品稳定的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通常是选在等电点附近，从而提高沉淀法的分辨力。
d.离子强度。离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5%为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。
有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀。减少其中有机溶剂的含量，如必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。
（3）选择性变性沉淀法 这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯目的物，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。
①热变性。利用生物大分子对热的稳定性不同，升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀，目的物保留在溶液中。此法简单易行，不需消耗任何试剂，但分离效率低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。热变性方法对分离耐热蛋白等生物大分子很有效，可方便地除去绝大部分杂蛋白。
②表面活性剂和有机溶剂变性。不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。此法通常在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性。
③选择性酸碱变性。利用蛋白质和酶等对于溶液不同pH的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。
（4）等电点沉淀法 等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉法，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因此常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。
（5）有机聚合物沉淀法 有机聚合物是20世纪60年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来，广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是聚乙二醇HCCH2（CH2OCH2）nCH2OH（n＞4）（polyethylene glycol，PEG），它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，相对分子质量范围广泛，在生物大分子制备中，用得较多的是相对分子质量为6000～20000的PEG。
PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和相对分子质量有关，同时还受离子强度、溶液pH和温度等因素的影响。在一定的pH下，盐浓度越高，所需PEG浓度越低，溶液的pH越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG的浓度越低。在一定范围内，相对分子质量高和浓度高的PEG沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有以下几点：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用；②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀；③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出；④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫积聚在一起而发生沉淀。
本法优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性；②沉淀效能高，使用很少量PEG即可以沉淀相当多的生物大分子；③沉淀后有机聚合物容易去除。
2.透析
透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。
原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。
影响透析速度的因素：
（1）半透膜的通透性 常用的半透膜是玻璃纸或赛璐玢纸、火棉纸或其他改性的纤维素材料。有商品化的不同型号的透析膜，透析管。
（2）透析外液的更换 反复更换透析外液，增加透析速度；对流水透析，可进行初期透析；搅拌，使梯度差变得均匀，可增加透析速度。
（3）温度 温度增加，则透析速度增加，但要注意生物活性。
（4）压力 增加压力可加快透析速度，如真空透析。
3.超滤
超滤是以压力为推动力，利用超滤膜不同孔径对液体中溶质进行分离的物理筛分过程。
其截断相对分子质量一般为6000～50万，孔径为几十纳米，操作压力为0.2～0.6MPa。
（1）超滤的主要应用
①浓缩。使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。
②梯度分离。按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离相对分子质量相差10倍以上的分子组分。在超滤过程中，虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。
③脱盐/纯化。脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。通过溶剂交换，可最有效地去除溶液中的小分子物质，并逐渐分离纯化出大分子物质。具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。
（2）超滤法的典型用途
①对蛋白质、酶、DNA、单克隆抗体、免疫球蛋白进行浓缩和脱盐；
②药物、激素分离；
③从PCR扩增仪的DNA中去除引物；
④去除标记的氨基酸和核苷酸；
⑤HPLC样品制备；
⑥从样品中除蛋白；
⑦从生物体液、发酵肉汤培养基中纯化抗生素、激素和药物；
⑧从细胞悬液、裂解液中回收生物分子；
⑨对蛋白质、酶、细胞、DNA、生物分子、抗体和免疫球蛋白进行浓缩和脱盐；
⑩哺乳动物细胞的收集；
4.反渗透
利用反渗透膜选择性地通过溶剂（通常是水）而截留离子物质的性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。操作压差一般为1.5～10.5MPa，截留组分为小分子物质。
5.纳滤
纳滤（Nanofiltration，NF）是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程。纳滤分离范围介于反渗透和超滤之间，截断相对分子质量范围为300～1000，能截留透过超膜的那部分有机小分子，透过无机盐和水。
（1）纳滤膜的特点
①纳滤膜的截留率大于95%的最小分子约为1nm，故称为纳滤膜。
②能透过一价无机盐，渗透压远比反渗透低，故操作压力很低，达到同样的渗透通量所必须施加的压差比用RO膜低0.5～3MPa，因此纳滤又被称作“低压反渗透”或“疏松反渗透”（Loose RO）。
（2）应用
①小相对分子质量的有机物质的分离；
②有机物与小分子无机物的分离；
③溶液中一价盐类与二价或多价盐类的分离；
④盐与其对应酸的分离。