第三章 生物化学基础实验

实验1 3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖

【目的要求】

1.掌握还原糖和总糖的测定原理。

2.学习用比色法测定还原糖的方法。

3.学习可见分光光度计的使用方法。

【实验原理】

还原糖的测定是各种糖类化合物定量测定的基本方法。在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热后3，5-二硝基水杨酸（DNS）被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物（图3-1）。在一定范围内，还原糖的浓度与3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质）颜色深浅的程度呈正比，利用可见分光光度计，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

还原糖是指含有游离醛基或酮基的糖类。在各种糖中，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，而蔗糖就是非还原糖。淀粉等多糖不显还原性。利用糖的溶解度不同，可将样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成具有还原性的单糖，然后进行测定，即可分别求出还原糖以及总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂1个糖苷键需加入1分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

【试剂与器材】

1.试剂、材料

（1）3，5-二硝基水杨酸试剂（DNS）将6.3g DNS和262mL2mol/L的NaOH溶液，加到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸氢钠，搅拌溶解，冷却后定容至1000mL。溶液为黄色，贮于棕色瓶中。

（2）1mg/mL葡萄糖标准溶液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯无水葡萄糖1g，置于烧杯中，加少量水溶解后再加5mL浓盐酸（防止微生物生长），以蒸馏水定容至1000mL。混匀，4℃冰箱中保存备用。

（3）碘-碘化钾溶液 称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂 称取1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

（5）6mol/L HCl溶液 取250mL浓HCl，用蒸馏水稀释到500mL。

（6）6mol/L NaOH溶液 称取240g NaOH，溶于1000mL蒸馏水中。

（7）小麦面粉。

2.器材

吸量管（0.5mL，10mL）；试管（25mm×250mm）；电子天平；漏斗、滤纸；容量瓶（100mL）；精密pH试纸；恒温水浴锅；擦镜纸；可见分光光度计；三角瓶（250mL）；电磁炉；白瓷板。

【操作方法】

1.绘制葡萄糖标准曲线

取6支25mm×250mm试管编号，按表3-1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂。

将上述各管混匀，用0号管调零点，于540nm波长处测定1～5管吸光度。以葡萄糖毫克数为横坐标，A₅₄₀为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2.样品中还原糖和总糖含量的测定

以测定小麦面粉中总糖和还原糖含量为例。

（1）样品中还原糖的提取 准确称取2.00g小麦面粉，放在100mL烧杯中。先以少量蒸馏水调成糊状，再加50～60mL蒸馏水，于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。转入100mL容量瓶中，再定容至100mL，过滤，取滤液测还原糖。

（2）样品中总糖的水解及提取 准确称取0.50g小麦面粉放入三角瓶中加入10mL6mol/L HCl溶液、15mL蒸馏水，置沸水浴中加热水解30min。取出1滴置于白瓷板上，加1滴碘液检查水解程度。若淀粉已水解完全，加碘则不呈现颜色。冷却后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色，蒸馏水定容至100mL，过滤。吸取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，即为稀释1000倍的样品水解液，用于总糖测定。

（3）样品中糖含量的测定 取7支25mm×250mm试管，编号，分别按表3-2加入试剂。

测定后，取还原糖及总糖样品A₅₄₀平均值，分别在标准曲线上查出相应的糖量，并按下式计算样品中还原糖与总糖的含量。

式中 m₀──由标准曲线上查得的葡萄糖的质量，mg；

V──样品稀释液总体积，mL；

m──样品质量，g；

0.5──吸取样品的量，mL；

1000──g换算成mg的系数；

0.9──还原糖换算成淀粉的换算系数。

【要点提示】

1.标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色（使用同一空白调零点和比色）。

2.样品比色前一定要混匀（漩涡混匀器）。

3.待测样品稀释倍数要合适，测定其A₅₄₀应在0.20～0.50范围内。

【思考题】

1.比色测定中要做一个空白管，“空白”的意义是什么？它对实验结果的影响如何？

2.如何正确绘制和使用标准曲线？