九、高糖环境下的分子表观遗传修饰
代谢失调对促进糖尿病肾病发展作用强而持久。在DCCT研究中，初始血糖控制不良的1型糖尿病患者，即使血糖控制良好，25年后糖尿病肾病的发生率仍在增加，这种被称为“代谢记忆”现象。有研究认为，不利的子宫内营养/代谢环境，包括严重的热量或营养过量与肾单位减少相关。这种减少会导致肾单位代偿性肥大和肾损伤易感性增加，会促进肾小球滤过率下降。这种现象被称为“发育编程”。表观遗传修饰可能是介导这些长期的环境编程的一个可能机制。
核酸与其组蛋白复合体的共价修饰是表观遗传调控的基础。代谢改变可以诱发表观遗传学的改变及由此产生的基因表达变化。例如，许多的染色体修饰酶利用由中间代谢产物产生的加合物作为辅因子。具体地，脂肪酸和葡萄糖代谢产生的乙酰基是组蛋白乙酰化的辅因子，而三酸循环中间产物是组蛋白和胞嘧啶甲基化所必需的。组蛋白或胞嘧啶修饰的改变能够引起基因转录的长期差异。细胞在高糖环境下培养后显示出表观基因组的持续性变化，例如组蛋白修饰谱。在糖尿病肾病患者肾小管上皮细胞的胞嘧啶甲基化水平显著提高。差异甲基化很少在启动子观察到，是由于该区大多与假定增强子区域重叠。差异甲基化的区域富集在重要转录因子的共同结合序列，这强调了表观遗传改变在基因表达调控中的重要性。与肾脏纤维化有关的基因核心组，包括编码胶原的基因，与下游转录本水平相关的胞嘧啶甲基变化有关。这些研究结果提出了表观遗传失调可能通过影响纤维化的核心调节因子在慢性肾脏病发展中发挥作用。
表观遗传学定义为“研究基因的核苷酸序列在不发生改变的情况下基因表达的可遗传性变化”。虽然已经发现了糖尿病肾病发病中的关键信号转导和基因调控机制，特别是那些与高血糖、TGF-β和血管紧张素Ⅱ的作用相关的机制，但表观遗传学的进展扩展了我们的视角，揭示了糖尿病肾病中涉及的新分子机制。这些机制包括DNA甲基化、染色质组蛋白修饰、染色质结构功能变化和非编码RNA研究，例如miRNA、lnc RNA和circRNA。
（一）DNA甲基化
DNA甲基化（DNA methylation）是指将DNA胞嘧啶核苷酸转化为5-甲基-胞嘧啶，实质上主要是在基因体内或基因启动子CpG“岛”周围形成“第五碱基”。DNA甲基化是基础性的基因表观遗传学修饰，不仅调节基因的表达，而且对染色体稳定性的维持有重要作用。DNA甲基化的调节作用复杂并且高度依赖基因组环境。DNA甲基化可以发挥多种作用，包括基因活化或沉默、转录因子的调节、转录延伸的调节和可变剪接。这可能是通过改变部分转录因子的结合和/或触发转录共抑制子的募集以保持基因沉默来实现。DNA甲基化可防止基因在错误的环境中被激活，或在需要转录时被沉默。在糖尿病肾病和慢性肾脏病患者的全基因组测序中均发现有不同程度的甲基化改变。研究发现，糖尿病肾病患者的CTGF基因启动子甲基化的水平随着尿蛋白水平增加呈现递减的现象。亚甲基四氢叶酸还原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）是人体叶酸代谢过程中十分重要的一种酶，它能够为同型半胱氨酸提供甲基，从而形成甲硫氨酸。研究表明MTHFR基因启动子区的甲基化水平与血清中同型半胱氨酸的水平密切相关。随着糖尿病肾病的进展，MTHFR基因启动子甲基化程度逐渐减弱，同型半胱氨酸逐渐升高，而同型半胱氨酸水平是糖尿病肾病的独立危险因素。
DNA甲基化修饰在糖尿病肾脏损伤中发挥重要作用，但是受肾组织标本获取较困难、测序所需样本量较大等限制，糖尿病肾病患者肾组织的DNA甲基化谱仍有待建立，且其参与糖尿病肾病发生发展的机制还需进一步研究。
（二）组蛋白修饰
染色质的基本结构是由200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体组成的染色质小体构成，这种结构保证了DNA处于高度浓缩的状态。而组蛋白转录后修饰（post-translational histone modification, PTHMs）会改变这种结构，因此组蛋白转录后修饰极有可能会影响到基因转录。组蛋白转录后修饰包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化和苏素化。当前研究较多的为组蛋白乙酰化和甲基化，它们和糖尿病肾病的发生发展有着更为密切的联系。组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase, HAT）和组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase, HDAC）是组蛋白和非组蛋白氨基末端结构域的双向可逆调节器。越来越多的证据表明，组蛋白修饰在糖尿病、糖尿病并发症和代谢记忆中有着重要作用。研究还发现组蛋白转录后修饰参与胰腺中胰腺和十二指肠同源物1（pancreatic and duodenal homeobox 1，Pdx1）对胰岛素表达的调节。高血糖可以导致Pdx1介导的HAT共激活因子p300募集增加，而后者可以通过增加组蛋白乙酰化和甲基化从而促进DNA解螺旋，最终使胰岛素转录增加。此外，当葡萄糖水平低时Pdx1也可能通过募集HDAC抑制胰岛素的表达。在HAT中，重要的大分子蛋白CREB结合蛋白（CREB binding protein, CBP）、组蛋白乙酰化酶氨合成通用控制蛋白5、p300/CREB结合蛋白相关因子和P300均可促进炎性反应发生，且CBP和P300还可增加TGF-β1诱导的基因表达从而促进糖尿病肾病的进展，而过度表达的HDAC1和HDAC5，可抑制TGF-β1诱导的基因表达。反之，抑制HDACs将增加结合位点中的组蛋白H3-赖氨酸9/14-乙酰化，促进基因的表达。HDAC家族中的去乙酰化酶1（sirtuins1，Sirt1）通过使组蛋白和转录因子去乙酰化调控足细胞封闭蛋白1的表达，进而维持足细胞的完整性。
虽然部分研究已经发现组蛋白修饰与糖尿病肾小球硬化密切相关，但组蛋白修饰在糖尿病肾病中的作用机制尚不清楚，对于肾脏特异性基因启动子的组蛋白修饰是否在糖尿病条件下发生改变仍有待进一步研究。
（三）非编码RNA
随着人类基因组研究的深入和“DNA元件百科全书”计划的完成，占据人类基因组约98%的“无用DNA”即非蛋白编码序列已被重新认识，约80%的DNA序列都能转录成RNA，且主要为ncRNA。ncRNA可粗略分成两类：一是短链ncRNA，主要为miRNA，其他的还有PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA, piRNA）、小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）等；另一是lncRNA。ncRNA分布广泛，在表观遗传、转录及转录后水平上对基因进行调控，且自身的表达也受到严密的调节，不同分子之间也存在相互作用，最终构成一个复杂的基因调节网络。近年来，随着对ncRNA研究的深入，越来越多的研究表明其参与糖尿病肾病的病理过程如由细胞外基质积聚诱导的纤维化、炎性反应、氧化及机械应激等等，并可能成为糖尿病肾病新的生物标志物及治疗靶点，同时也加速了人们对糖尿病肾病的精准认识。
1.微小RNA
miRNA是长度为21～24核苷酸高度保守的ncRNA，由具有发卡结构的单链RNA前体（precursor miRNA, pre-miRNA）经由Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA与AGO（Argonaute）等蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC）。RISC再与靶mRNA的3′端非翻译区的序列特异性结合，实现对靶基因的负性调控。其机制分为miRNA和靶基因mRNA完全配对和不完全配对，前者是抑制其翻译，后者是降解其mRNA。miRNA通常稳定，半衰期长，但在特定的环境刺激或细胞因子存在下，每个miRNA可以在特定的细胞中进行快速衰减。miRNA也可以主动分泌到细胞外微环境或体液中让其他细胞捕获，从而改变其转录方式。循环miRNA在血液、尿液和其他体液中包装成微泡，或由RNA结合蛋白和脂蛋白运输，从而保护它们免受核糖核酸酶降解。生物体中miRNA的特点是通过重复采集的非侵入性方式提高检测的准确性、特异性等，使miRNA有可能成为比蛋白质更好的生物标志物。目前已在人类中鉴定出超过1 500个miRNA序列。基于靶基因预测数据库主要包括Watson-Crick碱基配对［例如，TargetScan（www.targetscan.org），miRanda（www.microrna.org）和PicTar（www.pictar.org）］发现miRNA可能对应了数百个靶基因，这意味着部分mRNA可能在被单个miRNA翻译后被抑制或降解。然而，不同的miRNA可以结合并协同作用于单个mRNA靶标。有趣的是，单个miRNA也可以在特定mRNA的3′UTR中具有多个靶位点以增加其抑制效率。
（1）miRNA-21：
MiR-21是目前研究最多的miRNA，然而学者们的研究结果并不一致。在少数研究中，miR-21可以改善系膜扩张、蛋白尿、ECM聚集和足细胞丢失，阻止糖尿病肾病的发生，其他研究则认为miR-21表达增加导致疾病进展。
（2）miRNA-29：
MiR-29家族中的三个成员对糖尿病肾病的影响也并不一致：糖尿病小鼠中miR-29a过表达可以降低促纤维化因子表达从而限制肾脏纤维化；糖尿病患者血液样本或体外实验中肾组织miR-29b水平降低，而该miRNA靶点水平升高，miR-29b抑制或缺乏会促进肾纤维化和白蛋白排泄，提示该miRNA对糖尿病肾病有一定保护作用；而miR-29c表达上调会加剧炎症因子表达而使糖尿病肾病恶化。
（3）miRNA-93：
miR-93是一种糖尿病状态下的特征性miRNA，已被证明在糖尿病中被下调，而其在足细胞中过表达可通过丝裂原和应激激活蛋白激酶2介导表观遗传调控，进而阻止糖尿病肾病的进展。其他学者的研究则更具体地表明miRNA通过其对线粒体的调节作用发挥对慢性肾脏病疾病进展的调控。
（4）miRNA-135a：
据研究显示，miR-135a在糖尿病肾病患者中的表达显著上调，可抑制瞬时受体电位阳离子通道C亚家族成员1（TRPC1）的表达而减少因储存钙耗尽而导致的钙离子进入细胞，引起微量白蛋白尿和促进肾纤维化，从而促进糖尿病肾病的进展，TRPC1的过表达能够逆转miR-135a促进肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质合成增加的作用。
（5）miRNA-146a：
研究发现miR-146a缺陷（miR-146a-/-）小鼠出现严重的肾病症状，同时炎症细胞因子也大量增加，并推测miR-146a通过抑制炎症通路而降低糖尿病个体患肾病的风险，因而对糖尿病肾病有保护作用。
（6）miRNA-192：
miR-192是第一个被发现在糖尿病肾病中发挥作用的短链非编码RNA。研究表明miR-192在肾小球系膜细胞中表达上调，在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠和糖尿病db/db小鼠肾小球中表达上调。体外研究还发现E-box阻遏物Smad交互蛋白1（smad-interacting protein-1，SIP-1）是miR-192的靶基因。SIP-1可结合Ⅰ型胶原蛋白α2链（collagen type Ⅰ alpha2，COL1A2）基因中的E-box增强子元件，miR-192通过抑制SIP-1进而促进胶原蛋白的沉积。选择性敲除小鼠足细胞中的Dicer基因（调控足细胞miRNA生成关键酶的主要基因），突变小鼠出现足细胞凋亡和衰竭、肾小球系膜扩张、毛细血管扩张及肾小球硬化，提示miRNA对保护肾小球滤过屏障很重要。
（7）miRNA-377：
在自发性和链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的糖尿病肾病小鼠肾脏以及体外高糖或TGF-β1培养的系膜细胞中miR-377表达上调，miR-377通过抑制靶基因蛋白MnSOD和p-21活化激酶，促进纤维连接蛋白的积聚。高糖及TGF-β1可导致人近端小管上皮HK-2细胞中的miR-29a表达下调。miR-29a可负调节胶原Ⅳ，且下调的miR-29a可进一步导致肾小管间质的纤维化。可见，miRNA与糖尿病肾病系膜增生、足细胞损伤、肾小管间质纤维化等密切相关，在糖尿病肾病的发病中起着必不可少的作用。
基于针对miRNA的治疗方法，恢复或阻断miRNA的表达和活性是非常有吸引力的，第1个用于治疗丙型肝炎的miRNA靶向药物（miravirsen）已进入Ⅱ期临床试验。目前，作为一种有效的抗纤维化治疗的miRNA，其只在慢性肾脏病的动物模型中被证明，因此有许多安全问题必须得到解决。然而，大多数miRNA的高度多效性取决于细胞类型，单一的miRNA不太可能诊断和预测糖尿病肾病。因此，随着生物学技术的发展，我们需要逐步建立非编码RNA网络，为疾病早期预测及治疗提供新的靶点。
2.长非编码RNA
lncRNA是一类长度大于200核苷酸的ncRNA，缺少特异完整开放阅读框并且无蛋白质编码功能。大部分由RNA聚合酶Ⅱ转录产生，ALU RNA由聚合酶Ⅲ转录产生；与mRNA相似，lncRNA在真核细胞基因组中普遍表达，同样具备5真帽子结构和多聚腺苷酸尾。根据lncRNA在基因组中与邻近蛋白编码基因的位置，将其分为5种类型：①sense（正义）lncRNA：转录方向与邻近蛋白编码基因转录方向相同；②anti-sense（反义）lncRNA：转录方向与邻近蛋白编码基因转录方向相反；③bidirectional（双向）lncRNA：可同时从与邻近蛋白编码基因转录方向相同与相反的两个方向发生转录；④intronic（内含子）lncRNA：从基因的内含子区发生转录；⑤intergenic（基因间）lncRNA：从两个基因的基因间发生转录。根据lncRNAs的机制，可以将其分为四类：信号、诱捕、引导和支架。
随着研究进展，lncRNA被发现具有多种功能。lncRNA可以在表观遗传、转录调控、转录后调控以及蛋白质代谢等水平发挥重要作用，从而在人类生长发育、代谢、衰老以及疾病进程中起关键作用。lncRNA通过组蛋白修饰调节蛋白编码基因的表达水平，是lncRNA常见的一种调节方式。lncRNA能够招募组蛋白修饰复合物至靶基因组，如启动子区域，使靶基因发生相应的组蛋白修饰。有研究表明至少有12种组蛋白修饰复合物参与了lncRNA的表观遗传修饰。lncRNA还可以通过表观遗传修饰改变染色质构象。另外，lncRNA可通过多种方式参与转录水平的调控，如直接作为调控因子、共调控因子，通过形成转录起始复合体实现调控等。最后，lncRNA在转录后水平可通过与互补的mRNA形成双链RNA，影响mRNA加工、剪接、转运、翻译和降解等过程，从而调控基因的表达。另有报道，lncRNA可互补结合mRNA，掩蔽其3′-UTR部位的靶miRNA结合位点，有助于该mRNA的稳定性并促进其翻译。与miRNA相比，lncRNA在不同物种间的保守性更低，并且它们对基因表达的调控比miRNA介导的转录后mRNA水平调节更加多样化。lncRNA可以在染色质水平影响基因表达。
（1）lncRNA PVT1：
有学者发现lncRNA PVT1是美洲原住民糖尿病终末期肾病的潜在位点，且PVT1的遗传变异在其他人群中已有报道和糖尿病肾病相关。在系膜细胞中，高糖刺激可以使PVT1的表达上调，而抑制了PVT1的表达可以相应地减少细胞外基质蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白Ⅳ型α1的表达。这些研究表明PVT1可能通过调节细胞外基质的增加进而参与糖尿病肾病的发生和发展。在人的系膜细胞实验中，PVT1上存在的四个miRNA（miR-1205，miR-1207-3p，miR-1207-5p和miR-1208）在高糖的刺激下表达会上调，提示PVT1也可能通过调节miRNA的激活而影响细胞外基质的增加。
（2）lncRNA MALAT1：
已有学者证明MALAT1与β连环蛋白构成的反馈环参与了肾病足突细胞损伤机制，也有人提出MALAT1表达与miR-23c存在拮抗作用，解除了后者对ELAVL1基因的抑制作用，最终导致细胞凋亡和肾纤维化。对糖尿病大鼠行十二指肠空肠旁路术后，研究人员发现肾组织中MALAT1及其靶蛋白血清淀粉样蛋白A3含量均下降，而大鼠肾功能明显好转。之前的研究也提示lncRNA MALAT1的水平增加和血清淀粉样蛋白A3，TNF和IL-6的基因表达上调有关，MALAT1在被抑制后可减弱高血糖导致的炎症反应。
（3）lncRNA-Tug1：
lncRNA-Tug1通过结合PPARGC1A基因上游Tug绑定元件，增强PPARGC1A启动子活性，调控PGC1α表达，改善糖尿病db/db小鼠足细胞的线粒体生物学活性等。
（4）lincRNA-Gm4419：
lincRNA-Gm4419可以通过与NF-κB的亚基p50直接相互作用激活NF-κB通路。Gm4419的敲除可明显抑制促炎细胞因子的表达和肾纤维化生物标志物的产生；而在高血糖条件下，Gm441的过表达可促进肾小球系膜细胞的炎症、纤维化和细胞增殖等。
（5）lncRNACYP 4B1-PS1-001：
在肥胖且有肾脏累及的2型糖尿病小鼠中，有研究者运用lncRNA芯片和定量RT-PCR技术观察到在肾组织中CYP4B1-PS1显著下调。lncRNACYP4B1-PS1-001在许多肾脏的细胞中都有表达，在小鼠的系膜细胞中，lncRNA CYP4B1-PS1-001可以逆转高糖刺激所致的系膜增殖。这些研究都提示长链非编码RNA lncRNA CYP4B1-PS1-001在小鼠系膜细胞增殖和纤维化中的重要作用，然而这些lncRNA对细胞外基质的异常调节机制仍然有待进一步阐明。
在糖尿病肾病动物模型和高糖环境下的系膜细胞中，长链非编码RNA-线粒体反义非编码RNA（ASncmtRNA-2）表达显著上调，且与促纤维化因子TGFβ1表达正相关，而加入活性氧抑制剂后，ASncmtRNA-2表达下调。这说明ASncmtRNA-2上调TGFβ1介导的促纤维化，并可能通过影响活性氧的氧化应激而介导糖尿病肾病进展。
目前，越来越多的lncRNA被发现，但大多数的lncRNA的功能和作用机制尚不明确。随着研究的深入，lncRNA有望成为糖尿病肾病新的诊断标志物及治疗靶点。
3.环形RNA
circRNA是一种通过反向剪接形成共价闭环而产生的ncRNA，不易被核酸外切酶降解，具有结构稳定性、组织特异性和进化保守性特点。目前，circRNA根据其序列的来源形式不同分为3类：外显子circRNA（exonic circular RNA, e-circRNA）、内含子circRNA（circular intronic RNAs, ciRNA）及外显子、内含子共同组成的circRNA（exon-intron circular RNA, EIci RNA）。circRNA的结构不同于线性RNA，例如长链非编码RNA含有5′-和3′-尾结构。由于检测和识别手段的局限，circRNA曾被错误地认为是没有任何功能的转录副产物。在过去十年中越来越多的证据表明，circRNA可能与动脉粥样硬化、神经系统疾病、朊病毒疾病和癌症相关。作为非编码RNA家族的成员，环状RNA广泛参与细胞内RNA介导的调控网络，在转录水平以及转录后水平对基因的表达起调控作用。目前的研究表明，环状RNA的功能主要包括以下四个：①环状RNA与miRNA的相互作用：部分环状RNA包含数个至数十个不等的miRNA结合位点，具有吸附miRNA的海绵功能。②环状RNA与蛋白质的相互作用：环状RNA可直接与蛋白质结合，也可通过RNA介导间接与蛋白质发生关联，影响蛋白质功能。③环状RNA对转录的调控。④环状RNA的翻译。目前关于circRNA在糖尿病肾病发生发展中的机制研究较少。最新的研究发现糖尿病db/db小鼠和高糖培养的系膜细胞中circRNA-15698表达上调，敲除circRNA-15698可显著降低Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和纤连蛋白的表达。进一步研究发现circRNA-15698可以作为miR-185的海绵体，导致其下游靶基因蛋白TGF-β上调，从而导致糖尿病肾病系膜外基质聚集。目前有关circRNA与糖尿病肾病的研究还鲜有报道。相信通过研究糖尿病肾病相关的circRNA，以探讨其发生发展的相关机制，为早期诊断和治疗提供分子依据，也将成为未来糖尿病肾病研究的新方向。