第四节 补体依赖的细胞毒性试验

淋巴细胞毒试验即补体依赖的细胞毒性（complement dependent cytotoxicity，CDC）试验，采用供者活淋巴细胞（外周血或脾脏来源）作为抗原，与等待移植受者的血清共同孵育，如存在相应抗体，在补体的作用下，发生抗原抗体反应导致淋巴细胞死亡。根据淋巴细胞死亡数量百分比判断交叉配型（crossmatch）结果。

PRA试验是大多数人类的HLA抗原与受者血清反应的结果，检测的是受者体内有无针对HLA抗原的抗体，反应具有广泛性。而CDC试验是供者的HLA抗原与受者血清的直接反应结果，其反应具有针对性、直接性的优点，但CDC试验反应的敏感性较PRA试验弱。建议移植前将PRA、CDC试验联合共同检测，是避免移植后发生超急性排斥反应的必查项目。

【原理】

供者活性淋巴细胞与受者血清共同孵育时，如果受者血清含有针对供者活性淋巴细胞的特异性抗HLA循环抗体，则抗体上的可变区蛋白将结合到抗原上形成抗原抗体复合物。加入兔补体后，补体的C1q结合在抗体补体结合位点，激活一系列补体成分，导致细胞打洞。淋巴细胞失去活性呈阳性反应，淋巴细胞便死亡。加入荧光终止液后，在荧光显微镜下观察，活细胞显示绿色，死细胞显示红色。

【方法与步骤】

1.淋巴细胞分离　取移植供者抗凝全血2ml加入装有2ml淋巴细胞分离液的试管内，1 800r/min离心15分钟，吸取白膜层，入另一试管内，加入适量PBS混匀，1 500r/min离心10分钟，去上清。 调整细胞浓度 2×109～6×109/ml。

2.按下表4-5操作程序加入各试剂。

3.在荧光显微镜下判定结果。

【临床意义】

要对CDC的结果进行临床解释，首先要了解CDC试验技术和分析方法，明确与抗体发生反应的靶细胞是T细胞或B细胞，其对CDC有重要意义。患者体内存在直接杀死或溶解T淋巴细胞抗体（T细胞CDC阳性）是移植的禁忌证；而B淋巴细胞CDC阳性在一些报道中是可做移植的，因为B淋巴细胞抗体是免疫增强抗体，对移植物有保护作用，从而可获得良好的移植效果。

CDC结果的判断和临床意义见表4-6。

【注意事项】

1.本试验为十分精细的试验，每一步均需小心，仔细操作，以使血清、淋巴细胞和补体充分混合。

2.为保证淋巴细胞分离纯度，要求尽量减少多核细胞、红细胞及血小板的污染，污染过多的多核细胞和血小板会吸收抗体而出现假阴性结果，造成读数误差。

3.淋巴细胞浓度应在2×109～6×109/ml的范围（在倍镜下观察淋巴细胞有间隙而不成堆或散在），浓度过稀或过密都将影响试验的正确性。

4.为保证细胞-补体-血清的充分反应，加板后一定要轻轻振荡摇匀。

5.试剂开封使用后，考虑到荧光终止剂、阳性血清、淋巴细胞分离液的稳定性，建议2个月内用完。