第一节 环孢素A治疗药物监测

CsA是一种从真菌中得到的由11个氨基酸组成的环状多肽，是一种强效免疫抑制剂，临床主要用于防治实体器官移植和骨髓造血干细胞移植等同种异体移植时的排斥反应，也用于治疗自身免疫性疾病。由于其口服吸收不完全，用药时间长，个体差异大，治疗窗较窄，毒副作用较多，且血药浓度易受多种因素影响，因此临床需定时对CsA进行TDM，以实现个体化给药。

【药代动力学】

CsA口服后主要在小肠吸收，吸收慢而不完全，个体差异大。口服CsA的达峰时间（T_max）为2～4小时。峰浓度（C_max）在肾、肝、骨髓、心脏移植患者中，采用不同样品、不同测定方法时有很大差异。CsA被吸收后最初分布在血中，与血细胞和血浆蛋白的结合率都很高，血液中CsA约80%被红细胞摄取，少部分与血浆脂蛋白和其他蛋白质结合，4%～9%结合于淋巴细胞；血浆中游离药物仅为5%。CsA主要在肝脏由细胞色素P450肝微粒体酶系统进行广泛代谢，产生羟化、去甲基、环化，但母环结构不变。代谢物和原形药进入胆汁从粪便排出，约1%经尿排出，其T_1/2为10～27小时。目前已发现近30种代谢产物包括AM1、AM9、AM4N等，两个主要活性代谢物AM1和AM9，其免疫抑制活性只有母体的10%～20%。

【TDM事项】

1.样本要求

EDTA-K₂抗凝全血1～2ml。

2.TDM时机及频率

（1）监测时机：

根据肾移植术后时间和受者病情制订TDM时机。①肾移植术后CsA首次TDM应在口服给药3天后（浓度达稳态），静脉给药1次后即可TDM；②短期内（一般指术后住院期间）隔天检测，直至达靶浓度；③在更改CsA剂量和剂型、合并使用可或潜在影响CsA浓度的药物时，应在3天后或随时监测；④肾功能下降（CsA毒性或排斥反应所致）和疑似CsA导致的其他严重不良反应（如腹泻、头痛和血压升高等）时，可随时监测。

（2）监测频率：

肾移植术后1个月每周2～3次；术后2个月每周1～2次；术后3个月应每2周1～2次；术后4～6个月每3周1～2次，术后6～12个月每月1～2次；术后1～2年以上每季度1～3次；术后3年以上每年1～4次。任何原因导致的CsA血药浓度异常波动，应增加CsA的TDM频次。

3.TDM指标

CsA血药谷浓度C₀（服药后12小时或下次服药前0.5小时采样）和峰浓度C₂（服药后2小时采样），必要时可监测浓度时间曲线下面积（AUC）。

如果微泵连续24小时无间断给药，可随时采样以监测持续的CsA稳态血药浓度。

4.治疗窗

最常用维持治疗方案是CsA+抗增殖类药物（MPA类药物或咪唑立宾）+糖皮质激素三联免疫抑制方案。不同的治疗方案和受者，应该制订个体化的CsA目标治疗浓度。如果联合西罗莫司，其目标浓度应相应的降低。

器官移植免疫抑制剂临床应用技术规范（2019版），在CsA+MPA类药物+激素方案中，CsA的C₀参考范围：术后1个月内150～300ng/ml，1～3 个月 150～250ng/ml，4～12 个月 120～250ng/ml，1年以上大于80～120ng/ml。CsA的C₂参考范围：术后1个月内1 000～1 500ng/ml，1～3 个月 800～1 200ng/ml，3～12 个月 600～1 000ng/ml，1 年以上大于 400ng/ml。

【TDM方法】

全血是理想的TDM标本，目前认为测定全血CsA浓度比测定血清或血浆CsA浓度容易得到稳定的结果，且能反映临床的治疗效果和不良反应。目前CsA的TDM方法主要是免疫法，包括CMIA、EMIT和ECLIA。

1.CMIA法

（1）适用仪器：

雅培公司（Abbott）的ARCHITECT系统检测平台，如i1000和i2000仪器等。

（2）检测原理：

全血中CsA与CsA抗体包被的微粒子相结合；冲洗后加入吖啶酯标记的CsA结合物；再次冲洗后，将预激发液和激发液加入到反应混合物中；测量产生的化学发光反应（以发光单位RLUs表示），样本中CsA含量（即浓度）和RLUs值之间成反比（图7-3）。

（3）方法步骤

①缓慢颠倒样本5～10次或轻轻涡旋混匀；

②精密吸取混匀样本200μl至1.5ml离心管中；

③精密吸取100μl CsA全血溶解试剂，加入离心管，涡旋混匀5～10s；

④吸取400μl CsA全血萃取试剂，盖上离心管盖子，强力涡旋10～20s；

⑤离心5min以上，转速10 000g/min以上；

⑥上清液轻轻倒入ARCHITECT移植预处理管中，并盖上盖子；

⑦涡旋混匀移植预处理管中的上清液5～10s，须避免产生气泡；

⑧混匀后的移植预处理管转移到样品架上，载入仪器进行检测。

（4）方法特点：

校准范围0～1 500ng/ml。检测范围30～1 500ng/ml。检测限30ng/ml。存在交叉反应的CsA代谢物包括 AM1、AM1c、AM4N、AM19 和 AM9。

2.EMIT法

（1）适用仪器：

西门子公司（Siemens）EMIT分析平台，Viva-E分析仪。

（2）检测原理：

全血中CsA与经葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）酶标的酶试剂B中的CsA竞争结合位点。有活性（未结合）可以将抗体试剂A中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）转化成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），从而造成吸光度的改变，应用分光光度法进行检测。而与抗体结合后，酶的活性会降低，就可以根据酶的活性来确定样本中的CsA的浓度（图7-4）。

（3）方法步骤

①缓慢颠倒样本5～10次或轻轻涡旋混匀；

②精密吸取混匀样本100μl至1.5ml离心管中；

③精密吸取300μl样本前处理液加入离心管，并立即盖上盖子；

④将离心管振荡涡旋至少10s（充分混匀）；

⑤将混匀后离心管在室温条件下（18～25℃）静置至少1min，以使反应完全；

⑥离心10min，转速13 000g/min；

⑦将上清液转移至样本杯中，避免气泡产生，载入仪器，开始检测。

（4）方法特点：

校准范围0～500ng/ml。检测范围40～500ng/ml。检测限40ng/ml。存在交叉反应的CsA代谢物包括AM1、AM4N、AM19 和 AM9。

3.ECLIA法

（1）适用仪器：

罗氏公司（Roche）ECLIA分析平台，Cobase411、601、602分析仪等仪器。

（2）检测原理：

总检测时间18min。第1次孵育（9min）：CsA特异性生物素化抗体和钌络合物标记的CsA衍生物与20μl预处理样本一起孵育。免疫复合物形成的过程中，标记的抗体空白结合位点一部分被分析物CsA占据，一部分被钌标记的半抗原占据。第2次孵育（9min）：添加包被链霉亲和素涂层的磁珠微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之间的反应结合到微粒上。将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过ProCell/ProXCell M被去除。电极加以一定的电压，使复合体化学发光，并通过电倍增器测量发光强度。仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得到检测结果（图7-5）。

（3）方法步骤

①缓慢颠倒样本5～10次或轻轻涡旋混匀；

②精密吸取混匀样本200μl至1.5ml离心管中；

③精密吸取200μl免疫抑制剂预处理试剂，并立即盖上盖子；

④将离心管振荡涡旋至少10s（充分混匀）；

⑤离心至少4min，转速至少10 000g/min；

⑥将上清液移至特定样品杯中，载入机器进行检测。

（4）方法特点：

校准范围0～2 000ng/ml。检测范围30～2 000ng/ml。检测限30ng/ml。存在交叉反应的CsA代谢物包括 AM1、AM1c、AM1c9、AM19、AM4N、AM9。

4.HPLC法

（1）检测原理：

HPLC法主要采用色谱分离技术测定CsA原型药物和代谢产物。

（2）方法特点：

HPLC法具有专一性强和灵敏度高的优点，是评价其他方法如FPIA法的依据。缺点：分析柱温需加热至70～75℃才能达到合适的分离度。分析柱仅能使用2～4周；CsA的紫外线（UV）检测波长是200～214nm，内源性杂质和药物的干扰很难排除，CsA样本前处理繁杂、耗时长，不适用于批量检测。不能满足临床对TDM需求的及时性，不作为临床常规TDM方法。