第五节　提高分析选择性和灵敏度的方法

紫外-可见分光光度分析法由于方法简单快速，设备价格低廉，具有较高的准确度和灵敏度等优点，使其在分析工作中占有重要的地位。但是建立在Lambert-beer定律基础上的经典单波长紫外-可见分光光度分析技术，无论是进行定性分析还是定量测定都要求待测试液必须是澄清、均一的溶液。

随着分析科学技术的发展，涌现出一些特殊的分光光度分析技术，如催化动力学分光光度法、胶束增溶分光光度法和固相分光光度法等，相对于其他的分析方法，催化动力学分光光度法操作方便，在灵敏度上高于普通光度法2～4个数量级，尤其近年来随着一些新的增敏剂应用显著提高了方法的灵敏度。胶束增溶分光光度法比普通分光光度法的灵敏度有较大程度的提高，摩尔吸光系数有的甚至高达106数量级。固相分光光度法使分离、富集、显色等步骤合为一体，具有简化分析手段、提高灵敏度和选择性的特点；与一般溶液分光光度法相比，其灵敏度可提高2～3个数量级；此外，利用固相载体的良好选择吸附富集的特性，从而明显增强该方法的选择性。这些特殊的分光光度分析技术大大提高了方法的灵敏度和选择性，简化了分析试验步骤，扩大了分光光度法的应用范围。

一、催化动力学分光光度法

动力学分光光度法是利用化学反应的速率与反应物、生成物或催化剂之间的定量关系，通过测量与反应速率成正比关系的物质的吸光度，进而求出待测物质的含量。

根据反应中是否有催化剂的存在可分为非催化动力学分光光度法和催化动力学分光光度法，用酶做催化剂时称之为酶催化动力学分光光度法。酶是生物化学催化剂，酶催化动力学分光光度法特效性强，不仅可用于测定酶的活性，也能用于测定底物、活化剂和抑制剂的浓度。

（一）动力学基础

1.动力学速率方程

对一普通的二组分反应体系

dD+eE→fF+gG

化学反应的速率ν，可以用单位时间内反应物浓度的减少或产物浓度的增加来表示：

式中C_D、C_E、C_F、C_G分别表示D、E、F、G的浓度。

在反应过程中，反应物的浓度逐渐减少，产物的浓度逐渐增大，因而在反应的不同瞬间反应速率是各不相同的。根据质量作用定律，当温度等条件不变时反应速率与该瞬间各反应物的浓度幂的乘积呈正比：

式中k为速率常数，它与反应物的浓度无关，只与反应时的温度、反应物的本质及溶剂性质有关。

2.反应级数

速率方程中反应物的方次之和称为该化学反应的反应级数，上述化学反应的级数为d+e。

反应级数是研究物质浓度对反应速率影响的关键，当反应速率只受其他因素影响而与反应物浓度无关时（即d=0，e=0），称为零级反应。其速率方程式为：

当反应速率与反应物浓度的一次方呈正比时（即d=1，e=0），该反应称为一级反应，速率方程式为：

一级反应在分析工作中应用十分广泛，因为只须简单的测定其反应速率，便可从速率-浓度的曲线上求得被测物质的浓度。对二级反应，加入过量的第二种反应物，便可使二级反应转变为假一级反应，从而使反应速率只与第一种反应物浓度有关而与其他的反应物无关，以此类推，多级反应都可以变为假一级反应。

（二）基本原理

催化动力学分光光度法（spectrophotometry by catalytic kinetics）是以催化反应为基础、通过测定催化体系中指示物质（反应物或产物）的吸光度A来确定待测组分（催化剂）含量的方法。

运用催化动力学分光光度法测定某一物质的含量时，必须选择一个合适的反应，在一定的试验条件下，该反应的速率取决于待测物质的浓度，这样的反应称为该待测物质的指示反应。

1.催化显色反应

设一显色反应在催化剂的催化下速度加快，指示反应为：

若产物F为在紫外-可见区有吸收的化合物，则选择F为指示物质，根据质量作用定律，速率方程为：

若只在占完成反应总时间的1%～2%的起始期间内测量反应速率数据，此时反应物D、E消耗不大，近似等于起始浓度，为常数，同时形成产物的量近似为零，可以忽略不计，催化剂H的量在反应前后不变也可视为常数。或者控制试验条件，使C_D、C_E的量很大，其浓度的改变可以忽略不计，即C_D、C_E为常数，与K′合并，则上式可变为：

积分后得

产物F的吸光度A与其浓度C_F符合Lambert-Beer定律，即代入上式得：

在试验条件一定时，ε、b为常数，与K″合并为K，得

（式7-14）为催化显色动力学分光光度法的定量依据。

2.催化褪色反应

设一退色反应，指示反应为：

反应物D的颜色随着反应进行浓度减少而逐渐退色，在催化剂的催化下退色速度加快，D的退色速率可表示为：

当E大量过量，反应物中D的浓度改变量可用仪器检测出来时，此时C_E可视为常数与K′合并，又通常设d=1，则此反应为假一级反应，上式变为：

上式积分得：

式中C_0D为反应物D的初始浓度，C_D为退色反应进行到一定时间t时的浓度。

反应物D的吸光度A与其浓度C_D符合Lambert-Beer定律，即设初始浓度C_0D对应的吸光度为A₀，退色至C_D时的吸光度为A_t，代入上式得：

（式7-18）为催化退色反应的基本定量关系。

在实际工作中，通常是催化显色反应和催化退色反应的定量分析依据。并常用作A-t曲线和的曲线进行条件选择，以对催化剂的浓度C_H进行测定。

（三）定量方法

在具体测定物质浓度时，可采用固定时间法、固定浓度法等来定量测定待测物质的含量，最常用的是固定时间法。

1.固定时间法

在催化反应进行到一固定时间（即t=常数）后，用快速冷却、改变酸度、加入能与反应物牢固结合的物质或能使催化剂失去活性的抑制剂等方法终止反应，然后测定此时指示物的吸光度A，t为常数则（式7-14）变为：

选择一系列C_H不同的标准溶液，并测定固定时间t时的吸光度A，绘制A-C_H标准曲线，然后由待测样品溶液的吸光度值求得样品中催化剂的浓度C_H。

2.固定浓度法

测量显色产物F达到一定浓度（一定吸光度值A）时所需的时间t。即此时C_F为常数，则A为常数，与K合并K0，（式7-14）变为：

配制一系列不同浓度C_H的标准溶液，测定达到一定吸光度A时的时间t，绘制曲线，然后由待测样品溶液经反应达到A时所需要的时间t求得C_H。

此外，还有斜率法（正切法）、标准加入法和根据诱导期长短测定物质浓度的方法等。相对于其他的分析方法，催化动力学分光光度法所需仪器设备简单，操作方便，在灵敏度上又高于普通光度法2～4个数量级，尤其近年来随着一些新的增敏剂应用显著提高了方法的灵敏度。

二、胶束增溶分光光度法

胶束增溶分光光度法是20世纪60年代后期发展起来的一类新型光度分析方法，它是利用表面活性剂来提高显色反应的增溶、增敏作用的一类分光光度法。表面活性剂的亲水及亲油结构特征，使一些不溶于水的螯合物由于胶束增溶生成水溶性物质，得以直接水相光度法测定。胶束相的介质性质与水相不同，引起吸收光谱变化，使显色体系吸光度增大，从而起到增敏作用。胶束增溶分光光度法比普通分光光度法的灵敏度有较大提高，摩尔吸光系数有的高达106L/（mol·cm）。

（一）胶束增溶分光光度法的增敏机制

胶束增溶分光光度法的增敏机制与表面活性剂的性质有关。表面活性剂按其电离后的活性部分的性质分为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂，还有一类极难电离的表面活性剂称为非离子型表面活性剂。这些表面活性剂都具有胶束增溶作用，但各种类型表面活性剂增敏作用的机制不同。

目前普遍认为，阳离子表面活性剂的增敏机制是由于其亲水性部分的端电荷与显色分子的阴离子彼此相互缔合，使得显色分子的π电子轨道能量降低，导致π→π*跃迁能级差变小，从而引起λ_max红移，显色反应的对比度增大；另外，阳离子表面活性剂的正电场对带负电的显色剂离子有浓集作用，促使金属离子和较多的显色剂阴离子相配合，生成具有确定组成的高配位化合物，从而增大了显色分子的有效吸光截面积，提高了显色反应的灵敏度。

阴离子表面活性剂的增敏机制主要是由于表面活性剂分子非极性部分的疏水作用，将显色剂分子的疏水部分包容在胶束内部，而显色剂的亲水部分则易与金属离子形成配合物，由于这种特殊介质环境的特殊作用，使得显色剂与金属离子的配合物水化作用显著降低，从而产生强烈的增敏作用，提高了显色反应的灵敏度。

非离子型表面活性剂的增敏机制是由于显色剂与表面活性剂之间形成氢键，金属离子和显色试剂形成的离子配合物则富集于非离子型表面活性剂胶束内，由于胶束内部环境与水溶液不同，因此，减少了金属离子的水解作用，使其配合物的配位数增加，从而增大了配合物的浓度和有效吸光截面积，提高了显色反应的灵敏度。

（二）胶束增溶分光光度法应用

各种类型的表面活性剂单独使用或几种共同使用都有增敏效应，并能改善显色反应的选择性和有色配位化合物的稳定性。表7-2为其应用示例。

三、固相分光光度法

通常的分光光度法是指溶液分光光度法，在溶液中显色和测定。Lambert-Beer定律中c是溶液的浓度，因此适用于溶液分光光度法。1976年日本科学家提出一种对固相中待测离子的有色配合物进行测定的光度分析方法叫固相分光光度法，由树脂相分光光度法、凝胶相分光光度法和泡沫塑料相分光光度法组成。该法使分离、富集、显色等步骤合为一体，具有简化分析手段、提高灵敏度和选择性的特点。与相应的溶液分光光度法相比，灵敏度可提高2～3个数量级。此外，利用固相载体的良好选择吸附富集的特性，从而明显提高该方法的选择性。

（一）基本原理

固相光度法的测定原理基于下列公式：

（式7-21）中A为测得的吸光度，A_配为固相中配合物的净吸光度；A_固为固相背景和基体物质本身的吸光度；A_显为固相中游离显色剂的吸光度；A_溶为固相微粒间隙中溶液的吸光度。一般情况下，当待测离子的配合物几乎完全吸附在固相时，A_溶可以忽略不计，A_配、A_固和A_显受固相装填技术的影响，装填技术不同会改变光程长度或引起散射，所以固相的装填方式必须一致；另外，如果显色剂本身无色，A_显也可以忽略不计。在理想的情况下，可以用相似条件下制备的固相空白作参比，然后选择固相载体中有色配合物的最大吸收波长处测定吸光度A_配。

当试液中待测离子完全被固相吸附时，根据吸附平衡的原理，待测物质的浓度与固相中配合物的吸光度有下列关系：

（式7-22）中ε_配为固相中待测离子有色配合物的摩尔吸光系数，L_固为经过显色固相的平均光程长度，C₀为原始试液中待测物质的浓度，V为原始试液的体积，m为固相的质量。从上式可以看出测定条件固定，当试液体积和固相质量固定时，A_配和ε_配之间可以得到良好的线性关系，这即为固相分光光度法定量分析的理论依据。

（二）测量方法

1.固相显色的方法

固相分光光度法通常选用树脂相、凝胶相、塑料泡沫相和滤纸相等作为固相载体。固相载体作为吸附剂通过搅拌或振荡吸附溶液中的待测离子、显色剂或配离子等，然后不用洗脱成溶液直接进行测定。其显色方式通常有三种：

（1）固相和显色剂一起加入试液中，固相直接吸附富集有色物质后测定。

（2）显色剂先吸附于固相载体上后再加入试液中。

（3）待测物质先吸附富集于固相中再与显色剂显色。

近年来一些研究中也出现了不用加入显色剂，直接利用一些选择性很强的特殊固相载体来测定待测物质的方法。

2.测定方法

固相光度法操作中最重要的环节是测定吸光度这一步骤。因固相本身的特点，对于固相在比色皿中的填充方式要求很高，已由滴管滴加后静置发展到利用高速离心来实现良好的装填效果，以保证测定的重现性。还有不用比色皿的薄层压片法、滤膜法等。

常用的测定方法有传统的单波长法、双波长法和导数法等，固相光度法与流动注射技术（FIA）相结合也成为一个重要的发展方向。固相光度法发展到今天，由于具有许多优点，已成为光度分析的一个重要分支。固相光度法的研究对象不再局限于测定一些简单金属离子，现已发展到测定非金属元素和生命元素、有机化合物等。测定范围也由环境水样扩大到矿样、海水、动植物组织、土壤、食品、饮料、药物以及催化剂等许多方面。随着固相光度法研究的不断深入，科学工作者对其研究范围不再局限于测量的过程和结果，而是对其原理、过程机制和理论以及各种影响因素之间的相互关联都进行了深入地探讨。另外，不断研究出新的固相载体，与其他技术的联用，使固相分光光度法在卫生化学中的应用范围进一步拓宽。