上篇　常见性病艾滋病实验室检测技术及策略

第一章　艾滋病实验室检测技术及策略

第一节　疾病概述

艾滋病又叫获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），因感染人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起以T淋巴细胞免疫功能缺陷为主的一种免疫缺陷疾病。HIV本身不会引发疾病，但因造成人体免疫系统CD4+T淋巴细胞破坏，免疫功能逐渐降低甚至最终丧失免疫功能，致使人体感染其他疾病甚至死亡。

一、流行病学

1981年，在美国西海岸最大的城市洛杉矶出现了4个临床上诊断为严重免疫缺陷伴多重感染的病例。流行病学调查显示，这几个病例均为男性同性恋者，既往一直都很“健康”，都患有卡氏肺囊虫肺炎（pneumocystis carinii pneumonia，PCP）、黏膜白念珠菌感染，且外周血几乎检测不到CD4+T淋巴细胞，而CD8+T淋巴细胞明显上升，使CD4+/CD8+T淋巴细胞比值倒置。同期，在美国东海岸的纽约市也发现了类似病例。由此这种罕见的病例被重视，揭开了艾滋病被发现的序幕。1983年法国巴斯德研究所的Montagnier及其同事从一名男性同性恋者的淋巴结中分离到一株新反转录病毒，命名为淋巴结病相关反转录病毒（lymphadenopathy associated virus，LAV）。1983年秋天美国国立癌症研究所Gallo从一名患者的活体组织中分离到一种新的反转录病毒，命名为人类T细胞白血病病毒Ⅲ型（human T-cell lymphotropic virus type 3，HTLV-3）。同一年美国加州大学Levy等也宣布从患者的末梢血中分离到新的病毒，并命名为艾滋病相关反转录病毒（AIDS-associated retrovirus）。后来发现，以上3位学者分离出来的病毒实际上是同一种病毒，1986年国际微生物学会及病毒分类学会将这些病毒统一命名为人类免疫缺陷病毒。

自1981年以后，艾滋病由美国逐渐向全球蔓延。1985年，自非洲性工作者体内分离出2型HIV（HIV-2）。1985年，我国首例输入性艾滋病病例在协和医院确诊。据中国疾病预防控制中心（Chinese Center for Disease Control and Prevention，CDC）、联合国艾滋病规划署（Joint United Nations Programme on HIV/AIDS，UNAIDS）、世界卫生组织（World Health Organization，WHO）联合评估，截至2018年底，我国估计存活HIV感染者/AIDS患者约125万，截至2020年10月底全国报告实际存活HIV感染者/AIDS患者104.5万例。

HIV主要存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、组织液、淋巴液、脑脊液、乳汁等体液中，其主要传播途径为性传播、血液传播及母婴传播，目前没有证据证明HIV可以通过上述3种传播途径以外的其他途径传播。

1.性传播

在没有保护措施的情况下，与感染HIV的同性或异性发生有体液交换的性交，可导致HIV经性接触传播。2020年，中国疾病预防控制中心公布的数据显示，性传播途径占艾滋病传播方式的95%以上。性传播效率受性伴侣的性行为方式、性伴侣的数量、安全套的使用与否、性伴侣的性病感染情况影响。

2.血液传播

血液传播是20世纪末我国艾滋病开始流行时期的主要传播方式，也是HIV传播效率最高的方式。包括输入含有HIV血液（成分）或血液制品、或接触被含有HIV血液污染的相关器械造成的传播；共用未经消毒的注射器和针头静脉注射毒品等，其中输入受HIV污染的血液制品及器官移植造成的HIV感染率为100%。另外，医务人员以及公检法干警在工作的过程中，因接触到含有HIV的血液或体液而造成职业暴露感染，也是HIV经血传播的一个途径，但此种方式发生感染的概率很小，国外报道HIV职业暴露感染的可能性为0.5%。

3.母婴传播

感染HIV的妇女将HIV传染给其孩子称为母婴传播。母婴垂直传播是儿童和婴幼儿感染HIV的主要方式。感染HIV的妇女可通过妊娠、分娩和哺乳将HIV传染给婴幼儿。研究证实，母婴传播的危险性为20%～50%，在采取有效母婴阻断措施的情况下，传播率可降低至10%以下。

艾滋病被发现到现在的40年间，其传播途径、流行地域和感染人群等方面都发生了巨大的变化。目前我国艾滋病疫情传播方式已经由经血传播为主转变为经性传播为主，流行地区由边境和农村地区扩散至全国和大中城市，感染人群由高风险人群扩散到全人群，并在青少年和老年男性人群快速增长，分子流行病学研究显示，我国HIV毒株亚型众多，重组频发，我国艾滋病预防面临严峻挑战。

二、病原学

HIV属于逆转录病毒科、慢病毒属中的人类慢病毒组，为直径100～120nm的球形颗粒，由核心和包膜两部分组成。核心由衣壳蛋白（CA，p24）组成，衣壳内包括两条完全一样的病毒单股正链（RNA）、核壳蛋白（NC）和病毒复制所必需的酶类，如含有转录酶（RT，p51/P66）、整合酶（IN，P32）和蛋白酶（PR，p10）等；HIV的包膜来源于宿主细胞膜，其上嵌有病毒编码的包膜蛋白（envelope，Env）由跨膜的gp41与暴露在膜外的g120组成，自然状态下，每3个Env分子在病毒膜上组成一个有功能的三聚体，能与3个CD4受体特异结合，从而启动病毒感染靶细胞的过程。除Env外，病毒膜上还携带有宿主细胞源性的蛋白质，如I类组织相容性抗原（MHC-1），病毒膜的内侧面黏附有约2 000个病毒编码的基质蛋白p17（matrix protein，MA），构成基质壳（matrix shell）围绕在病毒核心结构的外面，基质蛋白在维持病毒结构和组装中起重要作用。HIV基因全长约9.8kb，含有gag、pol、env 3个结构基因、2个调节基因（tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节子）和4个辅助基因负性因子（nef）、病毒蛋白r（vpr）、病毒蛋白u（vpu）和病毒感染因子（vif）。

根据HIV血清学反应和病毒核酸序列测定可将HIV分为二型，HIV-1型和HIV-2型。经分子流行病学研究证实，HIV-1和HIV-2均起源于非洲，其核苷酸序列只有40%～60%的同源性。目前全球流行的主要是HIV-1，根据编码包膜蛋白的env基因和编码壳蛋白的gag基因序列的同源性，HIV-1型又进一步分为3个组，M组、O组和N组（new，or non-M，non-O），每种各有不同源头，其中传播最广的M和N早已证实来自黑猩猩，其中M组至今有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K共11个亚型。此外，近年来发现多个流行重组型。O组是1990年从喀麦隆和加蓬分离得到，与M组其他亚型的氨基酸序列只有50%的同源性，N组是最近从两名喀麦隆患者分离得到，在系统进化树上，既不属于M组，也不属于O组的一组新病毒，故称N组。HIV-2的生物学特性与HIV-1很相似，但其传染性较低，引起的艾滋病临床进展较慢，症状也较轻。HIV-2型至今至少有A、B、C、D、E、F、G共7个亚型。我国以HIV-1为主要流行株，目前已发现的有A、B（欧美B）、B’（泰国B）、C、D、E、F和G共8个亚型，以HIV-1型M组中的BB’、BC、CE和AE亚型流行为主。HIV-2型在发现早期仅在非洲局部地区流行，但随着经济发展全球化带来的人口流动增加也使HIV-2得以传播，1998年我国首次在福建省发现HIV-2感染者，目前呈点状散在分布，其中大部分病例为HIV-1和HIV-2混合感染。至今我国尚未发现有O型及N型的报道。

HIV在人体细胞内的感染过程主要包括：

1.吸附、膜融合及穿入

HIV-1感染人体后，病毒通过其表面的gp120与靶细胞的CD4受体相结合，使gp120的构象发生改变，暴露出结合位点，再次诱发gp41的构象变化，在辅助受体的帮助下进入宿主细胞。

2.反转录、入核及整合

在宿主细胞胞质中病毒以RNA为模板合成DNA负链，在反转录酶作用下，形成互补DNA，在DNA聚合酶作用下合成病毒双链线性DNA。在整合酶的作用下整合到宿主细胞的染色体DNA中，这种整合后的病毒DNA即被称为“前病毒”，又称病毒储存库。

3.转录及翻译

前病毒在细胞RNA聚合酶的催化下，病毒DNA转录形成RNA，一些RNA经加帽加尾成为病毒的子代基因组RNA；另一些RNA经拼接而成为病毒mRNA，在细胞核蛋白体上转译成病毒的结构蛋白（Gag、Gag-Pol和Env前体蛋白）和各种非结构蛋白，合成的病毒蛋白在蛋白酶作用下裂解，产生子代病毒的蛋白和酶类。

4.装配、成熟及出芽

前体蛋白与病毒子代基因组RNA在细胞膜的内面进行包装，gp120和gp41转运到细胞膜的表面，通过芽生与正在出芽的Gag和MA相结合从细胞膜上获得病毒体的包膜，形成独立的病毒颗粒，这些病毒蛋白与子代基因组RNA再进一步地组合，最后形成具有传染性的、成熟的病毒颗粒。

HIV-2的超微结构及细胞嗜性与HIV-1相似，在分子学特性方面，HIV-2与猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）相近，与HIV-1的结构蛋白差异较大，尤其是外膜蛋白。其核苷酸和氨基酸序列与HIV-1相比明显不同。

三、致病机制

HIV主要侵犯人体的免疫系统，包括CD4+T淋巴细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞等，主要表现CD4+T淋巴细胞数量不断减少，最终导致人体细胞免疫功能缺陷，引起各种机会性感染和肿瘤的发生。HIV进入人体后，在24～48h到达局部淋巴结，并在局部感染宿主细胞，与宿主细胞DNA整合形成前DNA。并通过转录和翻译产生新的病毒颗粒，5d左右在外周血中可以检测到病毒成分，继而产生病毒血症，导致急性感染，以CD4+T淋巴细胞数量短期内一过性迅速减少为特点。大多数感染者未经特殊治疗，CD4+T淋巴细胞数可自行恢复至正常水平或接近正常水平。由于机体免疫系统不能完全清除病毒，形成慢性感染，包括无症状感染期和有症状感染期。无症状感染期持续时间变化较大（数月至数十年不等），一般6～8年，且有逐渐减少的趋势，表现为CD4+T淋巴细胞数量持续缓慢减少（多为800～350个/μl）；进入有症状期后CD4+T淋巴细胞再次快速减少，多数感染者CD4+T淋巴细胞计数在350个/μl以下，部分晚期患者甚至降至200个/μl以下并快速减少。

HIV感染导致CD4+T淋巴细胞下降的主要原因包括：①病毒引起的CD4+T淋巴细胞凋亡；②病毒复制所造成的直接杀伤作用，包括病毒出芽时引起细胞膜完整性的改变等；③病毒复制所造成的间接杀伤作用，包括炎症因子的释放或免疫系统的杀伤作用；④病毒感染导致胸腺组织的萎缩和胸腺细胞的死亡等。

HIV引起的免疫异常除了CD4+T淋巴细胞数量减少，还包括CD4+T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK cell）和树突状细胞的功能障碍和异常免疫激活。人体通过固有免疫和适应性免疫应答对抗HIV的感染，黏膜是HIV侵入机体的主要门户，又是HIV增殖的场所，是HIV通过性途径传播的重要通道。女性宫颈、阴道和男性包皮上皮组织中有大量的朗格汉斯细胞，它们表达HIV识别的细胞表面受体CD4、CCR5和不同模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）。朗格汉斯细胞通过模式识别受体捕获HIV传递给T淋巴细胞，发挥“特洛伊木马”的作用。绝大多数患者经抗病毒治疗后，HIV所引起的免疫异常改变能恢复至正常或接近正常水平，即免疫功能重建，包括CD4+T淋巴细胞数量和免疫功能的恢复。

相对HIV-1感染者来说，HIV-2感染者的疾病进展缓慢，CD4+T淋巴细胞计数下降缓慢。通过性传播和垂直传播概率较低，病毒载量低，对非核苷酸类反转录酶抑制剂和几种蛋白酶抑制剂天然耐药，而这些药物是HIV-1基础治疗药。

四、临床表现

根据HIV感染后的临床表现及症状体征，可将HIV感染的全过程分为急性感染期、无症状期和艾滋病期。

1.急性感染期

通常发生在初次感染HIV后4周内。部分感染者出现HIV病毒血症和免疫系统急性损伤所产生的临床表现。大多数患者临床症状轻微，持续1～3周后缓解。临床表现以发热最为常见，可伴有咽痛、盗汗、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、关节疼痛、淋巴结肿大及神经系统症状。此期在血液中可检出核酸（RNA）和p24抗原，HIV前DNA病毒储存库阳性，而HIV抗体则在感染后2周左右开始出现，一般在感染后2～3个月均能检测到阳性，最长者6个月抗体才发生阳转。外周血淋巴细胞计数下降，随后淋巴细胞总数上升并可见异型淋巴细胞，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值亦可倒置。部分患者可有轻度白细胞和血小板减少或肝功能异常。快速进展者在此期可能出现严重感染或者中枢神经系统症状体征及疾病。此时期，在HIV抗体阳转之前，可通过HIV-RNA检测或P24抗原检测，结合流行病史来明确是否感染HIV。

2.无症状期

可从急性期进入此期，或无明显的急性期症状而直接进入此期。此期持续时间一般为6～8年。其时间长短与感染病毒的数量和型别、感染途径、机体免疫状况的个体差异、营养条件及生活习惯等因素有关。在无症状期，由于HIV在感染者体内不断复制，免疫系统受损，CD4+T淋巴细胞计数逐渐下降。可出现无其他原因引起的腹股沟以外两处或两处以上的淋巴结肿大，直径＞1cm，持续3个月以上，但一般不易引起重视。此时期，患者血清中HIV抗体和核酸均可检测到阳性，但经过规范性抗病毒治疗的患者，其外周血病毒可以很快被完全清除，导致HIVRNA降低到检测限以下。

3.艾滋病期

为感染HIV后的最终阶段。患者CD4+T淋巴细胞计数多小于200个/μl，HIV血浆病毒载量明显升高。HIV感染者或AIDS患者在半年内出现体重减少超过10%，伴有持续发热超过1个月，或者持续腹泻超过1个月、食欲缺乏、体虚无力等症状和体征，还可进一步出现相关神经认知障碍等症状。此时期，部分患者血清中可检测到抗原，极少数患者可能因为免疫力极度低下导致HIV抗体不确定。

五、诊断

HIV感染者/AIDS患者的诊断原则是以实验室检测为依据，结合临床表现和参考流行病学资料（包括不安全性生活史、静脉注射毒品史、输入未经HIV检测的血液或血液制品、HIV抗体阳性者所生子女或职业暴露史等）综合进行。HIV抗体和病原学检测是确诊HIV感染的依据；流行病学史是诊断急性期和婴幼儿HIV感染的重要参考；CD4+T淋巴细胞检测和临床表现是HIV感染分期诊断的主要依据；AIDS指征性疾病是AIDS诊断的重要依据。目前，我国HIV感染者/AIDS患者执行诊断标准为中华人民共和国卫生行业标准WS 293—2019版，其中规定如下：

1.诊断HIV感染标准如下

（1）成人、青少年及18个月龄以上儿童符合下列一项者即可诊断：

1）HIV抗体筛查试验有反应和HIV抗体确证试验阳性；

2）HIV抗体筛查试验有反应和核酸定性试验阳性；

3）HIV抗体筛查试验有反应和核酸定量试验＞5 000copies/ml；

4）有流行病学史或艾滋病相关临床表现，两次HIV核酸检测均为阳性；

5）HIV分离试验阳性。

（2）18个月龄及以下儿童符合下列一项者即可诊断：

1）为HIV感染母亲所生和两次HIV核酸检测均为阳性（第二次检测需在出生4周后采样进行）；

2）有医源性暴露史，HIV分离试验结果阳性或两次HIV核酸检测均为阳性；

3）为HIV感染母亲所生和HIV分离试验阳性；

2.诊断AIDS标准如下

（1）成人及15岁（含15岁）以上青少年符合下列一项者即可诊断：

1）HIV感染和CD4+T淋巴细胞计数＜200个/μl；

2）HIV感染和伴有至少一种成人AIDS 指征性疾病；

（2）15岁以下儿童符合下列一项者即可诊断：

1）HIV感染和CD4+T淋巴细胞百分比＜25%（＜12月龄），或＜20%（12～36月龄），或＜15%（37～60月龄）或CD4+T淋巴细胞计数＜200个/μl（5～14岁）；

2）HIV感染和伴有至少一种儿童AIDS指征性疾病。

六、治疗及预后

目前我国对HIV感染者/AIDS患者实行免费治疗的政策，旨在通过提供免费艾滋病抗病毒药物治疗，抑制HIV感染者/AIDS患者体内HIV复制，达到重建免疫系统目的，从而降低我国HIV感染者的发病率和病死率，并通过有效抗病毒治疗减少HIV传播。我国艾滋病治疗已取得突破性发展，发现大量抗病毒药物和联合用药疗法，大大降低艾滋病发病率和死亡率，艾滋病已有从超级癌症转变为慢性病的发展趋势。