第三章 甲状腺疾病分子生物学

第一节 分子生物学基本知识

一、分子生物学的定义

分子生物学是在分子水平上研究生命现象的科学。它通过对生物大分子（核酸、蛋白质）的结构、功能和生物合成等方面的研究来阐明各种生命现象的本质。如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，细胞信号的转录，发育的分子机制，癌的发生等。

二、分子生物学的起源

分子生物学是在结构分析和遗传物质的研究这两个重要的基础研究上形成和发展起来的。

1912年英国W.H．布喇格和W.L．布喇格建立了X射线晶体学，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。后来布喇格的学生W.T．阿斯特伯里和J.D．贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析，这些通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞生理功能的结构分析为生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。另一方面，从M．德尔布吕克小组1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜；1940年G.W．比德尔和E.L．塔特姆提出了“一个基因，一个酶”的假设（即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构）;1944年O.T．埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质；1953年J.D．沃森和F.H.C．克里克提出了DNA的双螺旋结构，在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动；1961年F．雅各布和J．莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控，到20世纪60年代中期，关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚，这些遗传物质的研究开创了分子生物学的新纪元。

仅仅30年左右的时间，分子生物学从大胆的科学假说，到经过大量的实验研究，为本学科奠定了坚实的理论基础，50年代分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展。

三、分子生物学的意义

现在，随着分子生物学技术的迅速发展已被广泛的用于实践中。对生物膜能量转换原理的研究，将有助于解决全球性的能源问题。对酶的催化原理的了解能更有针对性地进行酶的人工模拟，设计出化学工业上广泛使用的新催化剂，从而给化学工业带来一场革命。1973年重组DNA技术的成功，为基因工程的发展开辟了道路。80年代以来，已经采用基因工程技术，把高等动物的一些基因引入单细胞生物，用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。另外，分子生物学技术也被广泛的应用于临床和疾病研究中，如亲子鉴定，从基因调控的角度研究细胞癌变等，分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。

第二节 分子诊断学

一、定义

分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。

二、分子诊断分类

1．描述性诊断

以疾病的表型改变，如细胞学形态结构变化代谢产物的生化异常指标等，通过病理学、免疫学或细胞学的方法来判断疾病。常用诊断技术有细胞学检查，生化指标测定，免疫学诊断技术。

2．病因学诊断

通过对疾病基因的探测，基因的突变对疾病的病因、进展、转归作出准确性和预测性诊断。常用的诊断技术有：核酸分子杂交技术、PCR技术、DNA序列分析及DNA含量测定（有流式细胞分析技术FCM和图像分析技术ICM）。

3．分子诊断学在医学中的应用

（1）感染性疾病的分子诊断：利用分子诊断技术早期、快速、特异的检测感染性病原体的DNA或RNA，对感染性疾病进行早期诊断和分型，并可对其进行耐药性检测及流行病学调查。

（2）遗传性疾病的分子诊断：通过分析患者的染色体、蛋白质和某些代谢产物，得出患者的基因型和是否存在基因突变，从而诊断患者是否有以及为哪种遗传性疾病，它比传统的诊断方式更准确，更有利于临床对遗传性疾病进行早期预防、早期诊断和早期治疗，从而达到减少或控制相关遗传疾病的发生，指导优生优育。

三、肿瘤的分子诊断

目前认为肿瘤是多种因素引起的癌基因和抑癌基因相互失衡导致的，利用分子生物学技术探寻每个肿瘤发生的相关基因，并通过对这些相关基因的检测来诊断肿瘤的发生、发展以及预后。

四、其他

分子诊断还被用于耐药性的检测，疗效监控，卫生防疫等。

随着分子生物学的不断发展，后基因组学的不断深入，分子诊断技术的不断更新，对疾病的诊断、治疗和预防将会到一个早期、快速、预测的新平台，极大的推动着现代临床医学的发展。

第三节 甲状腺肿瘤分子生物学进展

随着分子生物学技术在医学中的研究和应用，在内分泌肿瘤的研究和诊断方面取得了一定的进展和成果。目前，主要通过对与甲状腺肿瘤相关基因和特殊蛋白的研究，来了解这些基因突变和特殊蛋白的改变在甲状腺肿瘤的形成、发展和转移中起的作用，以及与肿瘤诊断和预后判断的关系。

一、与甲状腺癌相关的癌基因

1.Ret基因

Ret原癌基因定位于第10号染色体10q11.2区，全长60kb，由21个外显子组成；它编码的蛋白是一种跨膜酪氨酸酶受体蛋白，由细胞外区、跨膜区和细胞内区——酪氨酸激酶（TKS）区组成；它的配基为神经胶质细胞系的神经营养因子及neurturin。它与配基结合后，TKS区被激活，在细胞分化及增殖中起重要作用。目前研究表明，Ret原癌基因的重排会导致甲状腺乳头状癌（PTC），因通过研究发现90%以上的PTC中有Ret原癌基因的重排，有三种常见的重排方式：Ret/PTC1、Ret/PTC2、Ret/PTC3。同时有研究表明，Ret原癌基因导致的PTC增殖活性低，易发生淋巴结转移，但不发生远处转移，预后较好。而Ret原癌基因发生点突变与多发性内分泌肿瘤Ⅱ型和甲状腺髓样癌的发生密切相关。

2.Ras基因

Ras基因是一种GTP酶，有N-ras、H-ras和K-ras三种类型，都有4个外显子组成，它们均编码ras-P21蛋白。ras-P21蛋白位于细胞膜内侧，能与GTP结合，在连接信号传导通路中酪氨酸激酶和有丝分裂原活化的蛋白激酶起着中介作用。Ras基因通过点突变被活化，使ras-P21蛋白长时间与GTP结合，持续被活化，引起生长信号持续释放，导致细胞恶性转化。研究表明，Ras基因突变会导致40%～50%的甲状腺滤泡癌（FTC）和20%～40%的甲状腺滤泡型腺瘤的发生，并且Ras基因阳性的甲状腺腺瘤需要手术切除，以防恶变。

3.BRAF基因

BRAF基因属于raf基因家族，位于染色体7q34，有18个外显子，它编码是一种67～99KD的丝/苏氨酸蛋白激酶。研究表明，BRAF V600E基因突变可诱导甲状腺乳头状癌的发生，29%～83%的甲状腺乳头状癌和源于甲状腺乳头状癌的未分化癌存在BRAF T1799A基因突变，并且该基因突变在PTC的生长、浸润和去分化的演变过程中起着重要作用。

4.trk基因

trk基因主要定位于1 q21-22，它编码细胞表面跨膜蛋白酪氨酸激酶—神经生长因子受体。研究表明，trk基因5，端和其他基因融合，激活甲状腺乳头状癌的增殖分化，它在Ret/PTC表达的PTC和无Ret/PTC表达的PTC均可发挥其作用。

5.PAX8-PPARγ融合基因

PAX8-PPARγ融合基因是由于细胞染色体异位畸变t（2;3）（q13; p25），导致PAX8和PPARγ融合在一起形成的。研究表明，PAX8-PPARγ融合基因重排会导致甲状腺滤泡癌，并且PAX8-PPARγ融合基因重排和ras基因突变通过相反作用的两种途径诱导甲状腺滤泡癌的发生。

6.erBb-2基因

erBb-2基因是一种表皮生长因子受体的同源性基因。研究表明，其50%在PTC中表达，40%在FTC中表达，75%在甲状腺髓样癌中表达，同时58%在甲状腺腺瘤中表达。

7．高泳动I（Y）基因

高泳动I组蛋白（HMGI）是一组调节染色体结构和功能的核蛋白。研究表明，HM-GI（Y）基因在FTC中83%表达，在PTC中仅6%表达，可作为PTC和FTC的鉴别诊断。

二、与甲状腺癌相关的抑癌基因

1.P53基因

P53基因定位于17q13区，是一种由393个氨基酸组成的核磷酸蛋白，在细胞生长周期中起负调节作用，是细胞周期的控制点，在维持细胞正常生长，抑制细胞恶性增殖过程中起着重要作用。有研究表明，P53的表达情况与甲状腺癌的分化程度和浸润性有关，表达阳性率越高，肿瘤分化类型越差，肿瘤越容易发生浸润，因此常作为判断甲状腺癌预后的指标。

2.P27基因

P27基因定位于12q13区，属于细胞周期依赖性蛋白激酶抑制家族的成员之一。它通过抑制细胞周期依赖激酶（CDK）活性，阻断G1向S期转换，从而抑制细胞的过度增殖和肿瘤形成。有研究表明，P27在正常甲状腺组织中高表达，在甲状腺瘤中的表达高于在甲状腺癌中的表达，在甲状腺滤泡癌中的表达最低。

3.P16基因

P16基因定位于9q21区，是一种多肿瘤抑制基因。P16基因主要以启动子甲基化的突变方式导致甲状腺肿瘤的发生。研究表明，50%的甲状腺滤泡癌中有P16基因突变；44%的甲状腺乳头状癌中有P16基因突变；75%的差分化癌和85%的未分化癌中有P16基因突变，而正常甲状腺组织内只有13%P16表达。

4.Bcl-2基因

Bcl-2基因是从B细胞淋巴瘤中鉴定出来的癌基因，由t（14∶18）易位而激活，与细胞程序化死亡有关。是编码线粒体膜渗透性改变蛋白的一种抑癌基因，发生突变可使线粒体内钙离子和细胞色素C向外释放，从而诱发甲状腺癌的进一步发展。研究表明，Bcl-2表达阳性的肿瘤更具转移能力，对判断甲状腺癌的预后具有一定意义。

三、与甲状腺肿瘤有关的特殊蛋白

1．生长因子

正常人体的甲状腺滤泡细胞能够合成表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、转化生长因子（TGF）等，它们起调节甲状腺细胞的生长和分化功能，参与甲状腺疾病的发生发展的过程。其中EGF和TGF两者氨基酸序列具有高度同源性，可竞争性的与同一受体—EGFR结合，引发DNA合成和细胞增殖、转化，在肿瘤的发生发展中起重要作用。研究表明，EGF和TGFа能促进甲状腺癌的生长、转移和浸润，EGF-R的数量可能有助于预测肿瘤复发的危险度，但有人认为EGF-R和TGFа的表达与甲状腺癌的病理类型、临床分期及淋巴结转移等病理特征无显著相关性。

2．血管内皮生长因子（VEGF）

血管内皮生长因子（VEGF）是一种肝素亲和的外分泌二聚体蛋白，分子量为34～42kD，是已知最强的一种直接促进血管生成的血管生成因子。Klein等分别用免疫组化和原位杂交的方法证实了VEGF和VEGFmRNA在甲状腺癌中的表达显著高于正常甲状腺中，在有转移的甲状腺癌中的表达高于无转移的甲状腺癌，因此认为VEGF与甲状腺的恶变程度及侵袭性相关。另外有研究表明，VEGFmRNA在来源于滤泡细胞的甲状腺癌中的表达明显高于来源于C细胞的甲状腺癌，可作为髓样癌与其他类型的甲状腺癌的鉴别指标。

3．细胞周期蛋白（Cyclin）D1

是一组通过与Cyclin-依赖性激酶结合成复合物而参与细胞周期调节的蛋白。Cy-clinD1是一种G1相细胞周期蛋白，在G向S过度点对细胞周期的调控起着重要的作用。研究表明，CyclinD1在提示肿瘤侵袭性和预后的判断方面有一定作用，在伴有淋巴结转移且＞5 mm的甲状腺乳头状癌中的表达高于＜5 mm的甲状腺乳头状癌。

四、端粒酶

端粒酶是一种RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，是真核细胞染色体末端富含G的重复序列，具有逆转录酶的作用。Umbricht等研究发现，100%的甲状腺滤泡癌有端粒酶活性表达，腺瘤只有19%的表达，可作为甲状腺腺瘤与FTC的鉴别诊断指标，还可在甲状腺针吸细胞中检测作为判断结节良恶性的指标。

五、端粒酶逆转录酶

端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶的催化部分，是调节端粒活性的重要端粒酶相关基因。有研究表明，hTERT在FTC中100%表达，在PTC中69.2%表达，良性结节中28%表达，正常组织中不表达，hTERT的表达比端粒酶敏感性更强。

六、半乳糖凝集素

半乳糖凝聚素（galectin-3）是一种β-半乳糖苷结合的动物凝集素。研究表明，galec-tin-3在甲状腺癌中高表达，在滤泡型腺瘤中不表达，galectin-3还可用免疫过氧化物酶染色在针吸细胞中进行，因此成为较好的诊断指标。

我们还必须认识到分子生物学技术还需要不断完善和发展，要使这些基因和肿瘤标志物真正成为临床诊断和治疗的依据工具仍需要长期艰苦的探索和努力。

（穆海霞 戴一菲 黄唯）