第三节 黄热病的实验室检测
一、样品采集
（一）采样前准备
根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采血技术规范的要求操作，遵守生物安全要求。
检查所需物品是否已准备齐全，并在有效期内，有无破损，是否足量，特别应检查受检者的信息与样品容器表面的标记是否一致，并注明样品采集时间。选择合适的室内（外）采血空间，受检者坐（卧）于合适的位置，准备采血用具、皮肤消毒用品、采血管及试管架、硬质废弃物容器等，并为样品制定编号，保证编号唯一性。
采血前，先对装有样品的离心管进行标记，核对后编码。要将标签贴在试管的侧面，最好使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。
（二）采集和处理样品
血浆：消毒局部皮肤，用真空采血管抽取适量静脉血，或用一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管中，轻轻颠倒混匀6～8次，用1500～3000r/min离心15min，上层即为血浆，吸出置于合适的容器中，备用。
血清：根据需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10mL静脉血，室温下自然放置，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15min，吸出血清，置于合适的容器中，备用。
采血完成后的穿刺针头必须丢弃于尖锐危险品容器里，妥善处理，防止发生职业暴露。
二、样品的保存
用于抗原检测的血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测样品的可存放于2～8℃，一周以上应存放于-20℃以下。
用于核酸检测的血清或血浆样品4天内进行检测的可存放于4℃,3个月以内的样品应存放于-20℃以下。3个月以上的样品应置于-70℃以下。
三、样品的运送
应符合生物安全要求，同时做好记录。随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息。
容器要求：不易破碎、带盖、防渗漏，外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，容器的材料还应易于消毒；样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。
四、样品的接收
样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的工作人员在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒，接收样品时应填写样品接收单。
核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒。检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并立即将样品情况通知送样人。
五、实验室检测
（一）一般检查
1．血常规：外周血白细胞减少，中性粒细胞比例减少，但血小板正常；
2．尿常规：蛋白尿，并有颗粒管型及红细胞；
3．粪便检查：大便隐血试验可阳性；
4．生化检查：血清转氨酶可升高，血清胆红素升高，重者达15～20 mg/dl（255～340 μmol/L），肝、肾功能异常，严重时可伴有低血糖；
5．凝血酶原时间延长，部分病例有DIC表现。
（二）血清学检测
黄热病毒只有一个血清型，但由于黄病毒之间存在交叉抗原，在进行血清学试验时应设立相应的对照，试验结果慎重解释。临床检测时需采集两份患者血液标本作诊断，第一份越早越好。IgM抗体、血凝抑制抗体和中和抗体在发病后5～7天内出现，补体结合抗体在病后7～14天内出现。用前后两份标本进行血凝抑制试验、中和试验和补体结合试验，比较效价增长情况，恢复期抗体比急性期增长4倍以上有意义。中和抗体的特异性高，有较大的诊断意义。但IgM和补体结合抗体存在的时间相对较短，可用于区别预防接种及自然感染，以及区别早期感染和既往感染。一般情况下，发病后第2天即可出现IgG抗体，第5天多数患者呈阳性。如果血清内有特异性IgG抗体且效价无动态变化，则提示患者过去曾感染过本病；有动态增长变化则提示患者处于疾病进展期。补体结合抗体和血凝抑制抗体与其他病毒有交叉反应，特异性不高。酶联免疫吸附试验（ELISA）及免疫荧光试验（IFA）等方法的敏感度和特异性高，适用于早期快速诊断。
1．中和试验
中和抗体和IgM抗体，血凝抑制抗体在发病后5～7天内出现。但中和抗体和血凝抑制抗体可长期存在。早在1962年，Groot等就对17年前接种过17D疫苗的人群进行了中和试验检测中和抗体，同时检测了血凝抑制抗体。中和试验的特异性较高，Borges等采用中和试验对接种疫苗后的人群进行检测，其敏感性为92.7%，特异性为90.8%，提示该方法适用于接种人群的中和抗体水平筛查。Niedrig等对209份接种人群标本中的17D特异性抗体水平分别采用中和试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验和ELISA试验进行分析，结果显示中和试验的敏感性最高。
2．血凝抑制试验
表面含有血凝抑制素的病毒，可以刺激机体产生血凝抑制抗体。Groot等人的研究显示血凝抑制抗体在接种黄热病毒疫苗人群中存在的比例普遍高于未接种人群，但未接种人群中有时也可以检测到血凝抑制抗体，可能与机体在接种前感染过其他病毒相关，提示血凝抑制试验存在假阳性的可能。
3．酶联免疫吸附法（ELISA）
对ELISA方法的敏感度和特异性评价不一。Niedrig等的分析结果显示对检测黄热病毒特异性抗体而言，ELISA、血凝抑制试验和免疫荧光法都不是可靠的血清学检测方法。Deubel等采用特异性抗原检测黄热病毒抗体，结果显示ELISA方法检测结果与中和试验相同，其敏感性和特异性优于血凝抑制试验和补体结合试验。ELISA方法操作简单，检测快速，可自动化，适用于临床开展黄热病毒的辅助诊断。
4．免疫荧光法
免疫荧光法与ELISA方法相反，免疫荧光法特异性高，可以鉴别非特异性反应，但敏感性低。间接免疫荧光法可检测抗原和抗体，检测特异性和敏感性均较高。Niedrig等人采用间接免疫荧光法检测黄热病毒感染患者体内的IgM和IgG抗体，并与噬菌体减少中和试验进行比较，结果显示两个试验的总相关性为98.7%，检测IgM抗体的灵敏度为94%，特异性为97%，检测IgG抗体的灵敏度和特异性均为95%。他们据此认为可作为黄热病毒快速诊断的检测方法。Monath等人研究显示对先前有黄热病毒感染的患者，免疫荧光法检测IgG抗体具有诊断意义，其特异性和中和试验相当，灵敏度高于补体结合试验。IgM抗体在初次感染和多重感染患者中都可高度特异地被检测，但不持久。免疫荧光法方法简单快速，适用于一站式的黄热病毒暴发流行病学调查。
5．免疫层析法
作为现代四大标记技术之一的纳米金标记技术近几年也被开发用于检测黄热病毒感染。湖北口岸重点实验室的研究人员利用分子生物学技术克隆黄热病毒的胞膜蛋白并进行表达纯化，制备纳米金免疫层析试纸，对21份阳性标本和30份阴性标本进行了试验，结果显示该方法与ELISA法无显著差异，可方便快速地检测病毒抗体。该方法不需要任何仪器，成本低廉，快速特异，适用于基层单位和床边即时检测。
6．黄热病毒相关的细胞因子检测
机体对黄热病毒的免疫包括体液免疫和细胞免疫，有大量文献报道了黄热病毒感染或疫苗接种后机体的体液免疫状况，但对细胞免疫研究甚少。Santos等采用了酶联免疫斑点分析方法检测了12位初次免疫健康人群体内的IFN-gamma和IL-4，结果发现接种15天后分泌两者的细胞数全部显著增加，提示细胞因子在黄热病毒感染过程中的重要作用。
（三）病原学检测
1．病毒培养及分离
黄热病毒属于黄病毒科黄病毒属的单链正义RNA病毒，颗粒直径约50nm。黄热病毒宿主细胞范围广，目前常用的细胞株包括猴肾细胞（MA-104, Vero, LLC-MK2）、兔肾细胞（MA-111）、乳鼠脑细胞、幼仓鼠肾细胞（BHK）、人组织细胞（HeLa, KB）、原代鸡胚细胞（CEF）及蚊细胞（C6/36）。利用细胞分离培养病毒是获得病毒株进行后续分子生物学和流行病学研究的基础。病毒分离应尽可能在疾病早期（发病最初3～5天内）采集患者血液接种后分离，或者死亡病例取肝组织进行病毒分离，然后采用特异性免疫血清进行中和试验鉴定病毒。
2．病毒抗原检测
病毒抗原检测的原理和抗体检测原理相同，采用的是抗原抗体特异性结合反应。黄热病患者早期血液中病毒滴度较高，可以通过检测病毒抗原予以诊断，目前常用的有ELISA法和免疫荧光法。ELISA方法的敏感性较病毒分离低，但简便快速，应用单克隆抗体检测可以避免和其他黄热病毒的交叉反应，有助早期诊断。此方法特异，敏感性较高，可在数小时内获结果，在一般实验室均可检测。直接免疫荧光法用于检测病毒抗原，特异性高，非特异性荧光染色因素少，操作简单，但敏感性低。姚嫁荣等人采用免疫荧光技术对感染黄热病毒的鼠脑切片和细胞抗原制片均能得到特异性的荧光反应。
3．病毒核酸检测
血清学检测无法避免有些标本存在抗体水平低或交叉反应问题，使诊断不能达到满意效果。PCR技术的发展为疾病早期快速可靠诊断奠定了基础，目前已较广泛地应用于临床诊断。目前用于黄热病毒检测的主要有逆转录PCR（RT-PCR）、实时荧光PCR、巢式PCR、实时逆转录环式等温扩增（RT-LAMP）、芯片杂交和微孔杂交等。
（1）逆转录PCR（RT-PCR）
RT-PCR是一种很灵敏的技术，可以检测到低拷贝数的RNA, RT-PCR的关键步骤是在RNA的逆转录过程。要求RNA模版纯度高。RT-PCR具有操作简单、灵敏度高等优点，广泛用于基因定量分析、生物学检测等。Ayers M等人分析了黄热病属的5种病毒NS5区域保守性，建立了这些病毒的一管式RT-PCR方法。Mendes JA等人采用RT-PCR技术检测野猴肝组织中黄热病毒，免疫组化技术检测病毒蛋白，进行流行病学监测。
（2）实时荧光PCR
实时荧光PCR是定量PCR的一种，动态检测一定时间内DNA的增量。荧光PCR使用荧光素做标记，标记方法分两种，一种在双链DNA中插入特异的荧光素，如SYBR Green荧光染料；另一种是与扩增后的DNA序列中特定核酸序列结合的荧光探针，如Taqman探针。两种方法原理不同。实时荧光PCR的实时性和逆转录PCR相结合，能用微量的RNA来检测特定时间、特定组织和细胞内特定表达的基因，且结果分析不需要电泳。师永霞等人建立了黄热病毒的实时荧光PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测，该方法检测黄热病毒与其他蚊媒病毒无交叉反应，最低可检测到20 copies病毒/反应，灵敏度高，特异性强。
（3）巢式PCR
巢式PCR也称套式PCR，是采用内外两套引物进行扩增，外引物同普通PCR相似，内引物称巢式引物，设计在第一次PCR扩增片段的内部，故第二次PCR扩增片段短于第一次扩增，优点在于如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。任瑞文等人的研究建立了稳定特异的巢式PCR快速检测黄热病毒的方法。Deubel等针对黄热病毒的NS5′和3′UTR设计了半巢式RT-PCR所需的3条引物，鉴定了黄热病死亡病例。M.P.Sanchez-Seco等人建立了简单可靠的检测和鉴定登革热病毒和黄热病毒的多重巢式RT-PCR方法，灵敏度和特异性均较高，可用于临床标本。
（4）芯片杂交和微孔杂交
基因芯片又称DNA芯片、生物芯片，原理是杂交测序。具有高通量、高度自动化等优点，但仍存在技术成本高、复杂、检测灵敏度低、重复性差、分析范围较狭窄等问题。张海燕等人根据黄热病毒基因组序列，并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片，结果大部分黄热病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号，阴性对照和空白对照检出阴性信号，为黄热病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。任瑞文等人结合PCR和ELISA初步建立了特异敏感实用的微孔杂交用于黄热病毒快速检测和鉴别的方法，结果直观，阳性标本吸光度值在0.5以上，阴性结果吸光度值在0.1以下，S/N值在10.0以上。
（5）环介导实时逆转录环式等温扩增（RT-LAMP）
等温扩增技术是在恒定的温度下，通过加入不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速扩增的目的。环介导核酸等温扩增技术是其中一种新颖的扩增方法。特点是对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件下保温30～60min即可完成扩增反应，具有简单、快速、特异性强等优点。Kwallah Ao等人建立了RT-LAMP技术对黄热病毒的快速检测方法，与RT-PCR相比，两者有相同的检测灵敏度，LAMP方法检测下限为0.29PFU/mL，检测时间缩短为1h。该方法为黄热病毒暴发流行区提供了简单快速可靠的检测工具。
总之，微量、快速、高通量、特异性高和自动化是现在黄热病毒检测方法的发展趋势。病毒分离培养的实验要求条件高，在普通实验室无法开展。而随着PCR技术的广泛应用，病毒的核酸检测无疑是最理想、最具发展潜力的检测方法。实时荧光定量PCR为病毒在特定时间表达特定基因提供了动态检测的结果。基因芯片和微阵列芯片杂交凭借其高通量和可自动化的优势必将在临床得到广泛应用。而纳米金层析法等血清学检测方法更适用于临床床边即时检测和常规的黄热病快速筛查。