第三节　蛋白质结构与功能

根据长期研究蛋白质的结果显示，所有蛋白质的特征是具有通过共价键和非共价键形成的空间构象。

一、蛋白质分类

蛋白质的分类方法至少有4种，一是根据蛋白质分子的形状，二是根据蛋白质组成，三是根据蛋白质的溶解性，四是根据蛋白质的功能。

1.根据分子的形状蛋白质可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质

（1）球状蛋白质　分子似球形，较易溶解，如血液的血红蛋白、血清球蛋白，豆类的球蛋白等。

（2）纤维状蛋白质　形状似纤维，不溶于水，如指甲、羽毛中的角蛋白和蚕丝的丝蛋白等。

2.根据组成蛋白质可分为单纯蛋白质和结合蛋白质

（1）单纯蛋白质　其组分只有α-氨基酸，自然界的许多蛋白质都属于此类。

（2）结合蛋白质　由单纯蛋白质与非蛋白质物质结合而成，主要包括如下几类。

① 色蛋白　为简单蛋白质与其他色素物质结合而成，如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。

② 糖蛋白　为蛋白质与糖类结合而成，如唾液中的黏蛋白、硫酸软骨素蛋白和细胞膜的糖蛋白等。

③ 磷蛋白　为蛋白质与磷酸结合而成，如酪蛋白、卵黄蛋白等。

④ 核蛋白　为蛋白质与核酸结合而成，存在于一切细胞中。

⑤ 脂蛋白　为蛋白质与脂类结合而成，如血清α-脂蛋白、β-脂蛋白及作为细胞膜和细胞主要成分的脂蛋白。

3. 根据溶解度蛋白质又可分为下列几类

（1）清蛋白　又称白蛋白。溶于水，如血清清蛋白、乳清蛋白等。

（2）球蛋白　微溶于水，溶于稀中性盐溶液，如血清球蛋白、肌球蛋白和大豆球蛋白等。

（3）谷蛋白　不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱，如米蛋白、麦蛋白。

（4）醇溶蛋白　不溶于水，溶于70%～80%乙醇，如玉米蛋白。

（5）精蛋白　溶于水及酸性溶液，呈碱性，含碱性氨基酸多（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸），如鲑精蛋白。

（6）组蛋白　溶于水及稀酸溶液，含精氨酸、赖氨酸较多，呈碱性，如珠蛋白。

（7）硬蛋白　不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液，如胶原蛋白，毛、发、蹄、角及甲壳的角蛋白和丝心蛋白以及腱和韧带中的弹性蛋白等。

4.根据功能蛋白质可分为活性蛋白质与非活性蛋白质

（1）活性蛋白质　包括在生命过程中一切有活性的蛋白质及其前体，如酶、激素蛋白质、运输蛋白质、运动蛋白质、贮存蛋白质、保护或防御蛋白质、受体蛋白质、毒蛋白质、控制生长和分化的蛋白质以及膜蛋白质等。

（2）非活性蛋白质　这类蛋白质对生物体起保护或支持作用。如硬蛋白，包括胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白和丝心蛋白等。

蛋白质的主要功能见表1-5。

二、蛋白质结构的组织层次

蛋白质分子不仅功能多样，而且结构十分复杂。为便于描述和理解这种复杂的结构，通常将蛋白质结构分为四个组织层次（organization level），并采用以下专门术语描述：蛋白质的一级结构（primary structure），指多肽链中氨基酸的排列顺序；蛋白质的二级结构（secondary structure），指在多肽链一级结构的基础上，主链原子按照一定的方式通过氢键而形成的有规则的α螺旋或β折叠等结构；蛋白质的三级结构（tertiary structure），指整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，借助非共价力相互作用，进一步盘曲折叠形成的特定的整个空间结构；蛋白质的四级结构（quaternary structure），指2个或2个以上具有独立的三级结构的多肽链（亚基），彼此借次级键相连，形成一定的空间结构（图1-23）。

蛋白质的一级结构中氨基酸残基是由共价键连接的。二级结构和其他高级结构主要是由非共价键如氢键、离子键、范德华力和疏水相互作用维系的。必须强调指出，一个蛋白质分子为获得复杂结构所需的全部信息都存在于一级结构即多肽链的氨基酸序列中。

三、蛋白质的一级结构

蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。维系蛋白质一级结构的主要化学键是肽键。氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从N末端向C末端书写。采用三字母符号时，氨基酸之间用连字符（—）隔开。

1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质，Sanger由此获1958年Nobel化学奖。1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素（图1-24）的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。

胰岛素（insulin）由51个氨基酸残基组成，分为A、B两条链。A链有21个氨基酸残基，B链有30个氨基酸残基。A、B两条链之间通过两个二硫键联结在一起，A链另有一个链内二硫键。

自1953年Sanger报道了牛胰岛素两条多肽链的氨基酸序列以来，已有100000多个不同蛋白质的氨基酸序列被测定（简称蛋白质测序）。

（一）蛋白质测序的基本策略

对于一个纯蛋白质，理想的方法是从N端直接测至C端，但目前一次只能连续测60个左右N端氨基酸。现在常用的蛋白质测序方法有两种：用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出氨基酸顺序的直接法；通过测定蛋白质的基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断氨基酸的顺序的间接法。用直接法测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的（纯度大于97%），而且是已知分子量的蛋白质。间接法的核苷酸的测序比蛋白质的测序工作更方便、更准确。

（二）蛋白质测序的直接法的一般步骤

① 测定蛋白质分子中多肽链的数目。根据末端分析可以确定蛋白质中不同的多肽链数目（因为不同的多肽链一般含有不同的末端残基）。如果是单体蛋白质或同多聚蛋白质则只含一种多肽链；如果是杂多聚蛋白质则含有两种或多种不同的多肽链。

② 拆分蛋白质分子中的多肽链。非共价力缔合的寡聚（或多聚）蛋白质，可用变性剂如尿素、盐酸胍或高浓度盐处理，可使多肽亚基解离。如果多肽亚基是不同的，则各亚基要用多种方式进行分离纯化。

③ 断裂多肽链内的二硫键。如果多肽链间是通过二硫键交联的，如胰岛素（含α和β两条链），则需要氧化剂或还原剂将二硫键断裂，方可使多肽链分开。

④ 分析每一多肽链的氨基酸组成。经纯化的多肽链样品一部分进行完全水解，测其氨基酸组成，并计算出每个蛋白质分子（或亚基）中氨基酸残基的数目。氨基酸组成的信息可以解释其他步骤的结果。

⑤ 鉴定多肽链的N末端和C末端残基。多肽链样品的另一部分进行N末端残基的鉴定，用作重建多肽链序列时的重要参考依据。

⑥ 多肽链部分裂解成肽段。用两种或几种不同的断裂方法（指断裂点不同）将多肽链样品降解成两套或几套肽段（或称肽碎片）。每套肽段进行分离、纯化，并对每一纯化了的肽段进行下一步的测序工作。

⑦ 测定各个肽段的氨基酸顺序。目前最常用的肽段测序方法是Edman化学降解法，并有自动测序分析仪可供利用。

⑧ 片段重叠法重建完整肽链的一级结构。利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠，可以拼凑出原来完整的多肽链的氨基酸序列。

⑨ 确定多肽链中二硫键的位置。

（三）蛋白质测序的一般方法

1.测序前的准备工作

在测定一个蛋白质的结构以前，首先必须保证被测蛋白质的纯度，使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数，按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。蛋白质的纯度鉴定要求纯度在97%以上，均一。主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法等。

2. N末端分析

（1）2，4-二硝基氟苯（DNFB）法　其基本原理已在氨基酸的化学反应中作了介绍。在弱碱溶液中，肽链N端的氨基酸残基可同2，4-二硝基氟苯（fluorodinitrobenzene，DNFB）起反应生成二硝基苯衍生物，后者为黄色物，可用乙醚抽提，用色谱法鉴定。其反应如图1-25所示。

蛋白质多肽N端游离α-NH2与2，4-二硝基氟苯（DNFB）反应形成DNP-多肽，用6mol/L HCl水解断裂所有肽键后，分离与二硝基苯基连接的N端氨基酸（黄色），通过色谱法与标准氨基酸比较鉴定。

（2）丹磺酰氯（DNS）法　原理同DNFB法，具强烈黄色荧光，灵敏度极高，且DNS-多肽水解后产生的DNS-氨基酸不需要提取，直接用纸电泳或薄层色谱鉴定。其反应过程如图1-26所示。

（3）氨肽酶法　氨肽酶（amino peptidase）是一类肽链外切酶，从肽链的N端每次降解一个氨基酸残基。原则上说，只要能跟随酶水解进程，将释放的氨基酸分别定量测出，就能测出肽的序列。但实际上由于酶的专一性等问题，在判断氨基酸序列时常会遇到不少困难。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶（leucine amino peptidase，LAP），除了N端的第二个氨基酸是Pro时，此酶不能将N端氨基酸水解下来外，其余所有N端的肽键都能被LAP水解，但水解速率相差很大。当N端为Leu时，水解速率最快。

（4）PITC法　瑞典科学家Edman首先用异硫氰酸苯酯（Edman试剂）来测定蛋白质的N端氨基酸，故此法又称Edman降解法（图1-27）。异硫氰酸苯酯在弱碱条件下可与多肽链的N端氨基酸的氨基作用，形成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（简称PTC-多肽或蛋白质），再在酸性溶液中使N端的PTC-氨基酸环化成苯乙内酰硫脲氨基酸（简称PTH-氨基酸），并从多肽链上脱落下来，用乙酸乙酯抽提，对其进行鉴定。

Edman降解法的最大优点是在酸性溶液中，仅仅是靠近PTC基的肽键断裂，其他肽键不断。每次递减一个氨基酸，如此重复多次就可以测定出一定数目的氨基酸序列。现代蛋白质序列仪的基本原理就是Edman降解法，逐个降解N端氨基酸。

3. C末端分析

（1）肼解法　是测定C末端残基最重要的化学方法。无水肼（NH2NH2）与多肽加热（100℃）发生肼解，C末端氨基酸以游离形式存在，其余的都转变为相应的氨基酸酰肼化物。用苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C末端游离氨基酸留在上清液中。可借助DNS法或DNFB法以及色谱技术进行鉴定。

（2）羧肽酶法　是最有效、最常用的方法，但Pro不能测。羧肽酶与氨肽酶相似，都是肽链外切酶，不同点在于羧肽酶从肽链的C端每次降解一个氨基酸残基，释放出游离氨基酸。用氨基酸的释放量对时间作图，可确定C端氨基酸的序列。

常用羧肽酶有四种，见表1-6。

（3）还原法　C端氨基酸与硼氢化锂还原成α-氨基醇，可用色谱法鉴别。 

4.二硫键的断裂

蛋白质结构分析中胱氨酸残基的二硫键常用氧化剂或还原剂打开。过甲酸可定量打开胱氨酸的二硫键，生成磺基丙氨酸（cyter acid）。还原剂如巯基化合物（R—SH）也能断裂二硫键，生成半胱氨酸及相应的二硫化物。

5.肽链的断裂

氨基酸顺序自动分析仪只能准确测定50个氨基酸残基以下的肽链，而一般的蛋白质都含有100以上的氨基酸残基，所以，要将蛋白质打断成多肽甚至寡肽，再进行分析，而且要2套以上，便于以后拼接。为此，经纯化并断开二硫键的多肽链选用专一性强的蛋白酶或化学试剂进行可控制的裂解。裂解时要求断裂点少，专一性强，反应产率高。

（1）化学裂解法　获得的肽段较大，适合自动序列仪。

① 溴化氰（CNBr）：水解—Met—X—之间的肽键，产率85%。

② 亚碘酰基苯甲酸：水解—Trp—X—之间的肽键，产率70%～100%。

③ NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）：水解—X—Cys—之间形成的肽键。

④ 羟胺（NH2OH）：水解—Asn—Gly—之间形成的肽键，专一性不强，也能裂解—Asn—Leu—和—Asn—Ala—之间的肽键。

（2）酶裂解法　用于肽链断裂的蛋白水解酶（或称蛋白酶）都是肽链内切酶或内肽酶。最常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等。几种蛋白水解酶的专一性如表1-7所示。

6.肽段氨基酸序列的测定

自动序列分析技术应用了Edman试剂——异硫氰酸苯酯。与Sanger测序技术不同，Edman法使多肽水解掉N末端残基后仍保留修饰肽链的完整性（即剩余的多肽不被水解），这一特征改变了蛋白质测序技术。在反应过程中，氨基端的氨基酸以苯乙内酰硫脲衍生物的形式释放，然后通过HPLC进行鉴定。序列中的下一个氨基酸接着发生衍生化并释放出来，这一过程不断重复，30～40个（偶尔也可60～80个）氨酰基的序列可在一次连续的操作中得以完成（图1-27）。

7.肽段拼接成肽链

通常采用重叠肽法确定各肽段在原多肽链中的正确顺序，拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。重叠肽是指用两种或两种以上的不同方法（专一性不同）断裂多肽样品，得两套或多套肽段。

例如：16肽，N末端—H，C末端—S

A法裂解产生的肽段　QNS，PS，EQVE，RLA，HQWT

B法裂解产生的肽段　SEQ，WTQN，VERL，APS，HQ

重叠肽法确定序列　HQWTQNSEQVERLAPS

8.二硫键位置的确定

二硫键位置的确定包括链内和链间二硫键的位置，用对角线电泳法来测定。在肽链未拆分的情况下用胃蛋白酶水解，可以得到被二硫键连着的多肽产物。先进行第一向电泳，将产物分开，再用过甲酸、碘代乙酸、巯基乙醇处理，将二硫键打断，最后进行第二向电泳，条件与第一向电泳完全相同。选取偏离对角线的样品（多肽或寡肽），它们就是含二硫键的片段，上机测氨基酸顺序，根据已测出的蛋白质的氨基酸顺序，把这些片段进行定位，就能找到二硫键的位置。

四、蛋白质的二级结构

多肽链在一级结构的基础上，主链原子按照一定的方式通过氢键有规律地旋转或折叠形成的空间构象就是蛋白质的二级结构。其实质是多肽链在空间的排列方式。主要包括α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲等。

1.构型与构象

构型（configuration）指一个分子由于其中各原子特有的固定的空间排列，而使该分子所具有的特定的立体化学形式。构型的改变只能通过共价键的破坏和再形成而实现（例如D-丙氨酸转变为L-丙氨酸）。

构象（conformation），是指一个分子中，不改变共价键结构，仅单键周围的原子旋转所产生的原子空间排布。构象之间的相互转化不涉及共价键的破坏，而是通过非共价键（氢键、盐键、疏水键等）的破坏与再形成而实现。即使消除了由空间相互作用所产生的构象，一个多肽链主链中2/3的共价键仍可自由旋转而形成无数个可能的构象，然而对于一个蛋白质来说，只有一小部分构象具有生物学意义。

2.多肽主链的折叠的空间限制

一个Cα原子相连的两个肽平面，由于N1—Cα和Cα—C2（羧基碳）两个键为单键，肽平面可以分别围绕这两个键旋转，从而构成不同的构象。一个肽平面围绕N1—Cα（氮原子与α-碳原子）旋转的角度，用Φ表示。另一个肽平面围绕Cα—C2（α-碳原子与羧基碳）旋转的角度，用Ψ表示。这两个旋转角度叫二面角。二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。Cα—N和Cα—C键旋转时将受到α-碳原子上的侧链R基的空间阻碍影响，所以使肽链的构象受到限制，只能形成一定的构象。构象Φ、Ψ示意图见图1-28。

Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标、以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。

3.二级结构中的规则和不规则构象

蛋白质多肽骨架的构象构成了它们的二级结构，可以通过X衍射分析方法来确定。肽键的部分双键性质和R基团的大小及形状决定其存在的二级结构种类。

（1）α螺旋结构　如果多肽链以α-碳原子为核心做角度相同的旋转，即可以形成线卷或螺旋结构。螺旋旋转的强度和方向不同，所形成的螺旋类型也不相同。螺旋沿着它的中心轴上升，每一圈的氨基酸残基数（n）或每圈的距离（p，螺距）决定了螺旋的类型。肽链中的肽平面绕Cα相继旋转一定角度形成α螺旋，并盘绕前进。每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈，每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100°（见图1-29）。α螺旋中氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。第1个肽键的上的氧和第4个肽键的上的氢之间形成氢键，第n个肽键的上的氧和第n+3个肽键的上的氢之间形成氢键。由氢键封闭形成的环是十三元环：

氨基酸具有手性特征，因此形成的螺旋亦有手性，即右手螺旋和左手螺旋之分。握住手掌，拇指向外，就构成右手螺旋。对一个右手螺旋的多肽链来讲，如果拇指指向肽链的羧基端，螺旋沿着手指卷曲的方向前进。绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋（见图1-30）。

由于α螺旋是多肽链中能量最低、最稳定的构象，由此可以自发地形成。但一条肽链能否形成α螺旋，以及形成的螺旋是否稳定，与它的空间位阻和静电斥力有极大的关系。多个　　　　　　

侧链较大的氨基酸（Ile、Trp、Phe等），由于极大的侧链基团而存在空间位阻而不能形成稳定的α螺旋；连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基因同种电荷的互斥效应而不能形成稳定的α螺旋。例如多聚Lys，当pH=7时R基都带正电荷，妨碍α螺旋的形成，而以无规则卷曲形式存在；当pH=12时则自发形成α螺旋。α螺旋遇到Pro会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸，其肽键N原子上没有H，不能形成氢键；且Cα原子参与吡咯环的形成，环内Cα—N和Cα—C键不能旋转。R为Gly时，由于C上有2个H，使Cα—C、Cα—N转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。

（2）β片层结构　也称β折叠结构，β片层（β-pleated sheet）是由两条或多条完全伸展的多肽链靠氢键连接而成的锯齿状片层结构。每条肽链称β折叠股或β股。形成α螺旋中的氨基酸在一级结构中均为邻近氨基酸，β片层则不同，其氨基酰残基可以来自于多肽链中不同一级结构区域的5～10个氨基酸构成的区段。与α螺旋的致密性结构相比，β片层构象几乎完全是伸展的。侧链基团与Cα间的键几乎垂直于折叠平面，R基团交替分布于片层平面两侧。β片层结构具有平行结构和反平行结构两种形式。

图1-31展示了反平行走向的β片层结构，相邻的两多肽链具有相反的方向；而平行的β片层结构中，两多肽链的走向是相同的。每一种β片层结构都具有特有的氢键类型（图1-32），并尽可能在所有可以形成氢键的原子之间形成氢键。在反平行的β片层构象中，宽窄相间的氢键位于两多肽链之间，对构象起到稳定作用。而在平行β片层中，氢键则是均匀存在且与肽链形成一定倾斜角度。几乎所有的β片层链都是右手卷曲的，卷曲的β片层可以形成球状蛋白质的核心。一个β片层结构可以由2～15条多肽段构成，平行和反平行β片层常混合存在。

（3）β转角结构　β转角也称β回折、β弯曲或发夹结构，多存在于球状蛋白质分子的表面，是多肽链180°回折部分所形成的一种二级结构。由第一个氨基酸残基的上的氧与第4个氨基酸残基的N—H上的氢之间形成氢键，形成一个紧密的环，使β转角成为稳定结构。主要有两种类型：Ⅰ型和Ⅱ型（图1-33），二者主要差别是中央肽基旋转了180°。

一些氨基酸如Pro、Gly经常出现在β转角中，而Ⅱ型β转角中的第3个氨基酸残基总是Gly。这是因为甘氨酸的侧链只有一个氢原子，在构象上几乎没有空间障碍，可以缓和由于肽链弯曲造成的残基侧链间的作用。脯氨酸则相反，其亚氨基与侧链形成环状结构，比较严格地限制了构象角的自由度，在一定条件下能导致β转角的形成。在球状蛋白质中，β转角是非常多的，可以占总残基数的1/4。大多数β转角位于蛋白质分子表面，多数由亲水氨基酸残基组成。

（4）无规则卷曲　无规则卷曲泛指那些不能被归入明确的二级结构元件的多肽区域。常出现在α螺旋与α螺旋、α螺旋与β折叠、β折叠与β折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。酶的功能部位常常处于这种构象区域。

α螺旋、β转角、β折叠在拉氏构象图上有固定位置，而无规卷曲的Φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。

五、超二级结构和结构域

在蛋白质中经常看到若干相邻的二级结构单元（主要是α螺旋和β折叠）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体，称为超二级结构。它们是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次，可直接作为三级结构的“建筑块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。现在已知的超二级结构有以下几种基本组合形式（图1-34）。

（1）αα　这是由两股或三股右手α螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。主要存在于α角蛋白、肌球蛋白等蛋白质分子内。α螺旋沿超螺旋轴有相当的倾斜，重复距离从0.54nm缩短到0.51nm。超螺旋的螺距约为14nm，直径为2nm。两股α螺旋的侧链能紧密相互作用，使超螺旋结构更加稳定。

（2）βxβ　是由两段平行的β折叠通过一段连接链（x结构）连接而成的超二级结构，主要有如下两种形式。

① βcβ　x为无规卷曲。

② βαβ　x为α螺旋，β片层的疏水侧链面向α螺旋的疏水面，彼此紧密结合装配。最常见的是βαβαβ，相当于两个βαβ单元组合在一起，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶的蛋白质中。

（3）β曲折　由多个相邻的反平行β片层股通过紧凑的β转角连接而成的超二级结构。

（4）回形拓扑结构（希腊钥匙）　回形拓扑结构（“Greek key”topology）也是反平行β折叠片中常出现的一种超二级结构。这种结构直接用希腊陶瓷花瓶上的一种常见图案命名，称“Greek key”拓扑结构。这种拓扑结构有两种可能的回旋方向，但实际上只存在其中的一种。这种选择的基础尚未确定。

长肽链（多于150个氨基酸）在超二级结构的基础上通过多次折叠，在空间上形成一些半独立的球状结构，叫结构域，它是三级结构的一部分，结构域之间靠无规则卷曲连接。也就是说结构域是将三级结构拆开后首先看到的结构。结构域具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。如一些要分泌到细胞外的蛋白质，其信号肽（负责使蛋白质通过细胞膜）就构成一个结构域。此外，还有与残基修饰有关的结构域、与酶原激活有关的结构域等。铰链区柔性较强，使结构域之间容易发生相对运动，所以酶的活性中心常位于结构域之间。小蛋白多由一个结构域构成，如核糖核酸酶、肌红蛋白等。由多个结构域构成的蛋白质一般分子量大，结构复杂，例如免疫球蛋白的重链含有4个结构域。

六、三级结构

蛋白质的三级结构是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置，包括主链和侧链。三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。一条长的多肽链，可先折叠成几个相对独立的结构域，再缔合成三级结构，这在动力学上比直接折叠更为合理。三级结构是蛋白质发挥生物活性所必需的。

（一）维持三级结构的次级键

三级结构涉及蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，但不涉及亚基之间的关系。三级结构主要靠非共价键如氢键、离子键、疏水键和范德华力等来维持。

1.氢键

氢键是次级键中发现最早的一种键，在维持蛋白质的构象中起重要作用。例如α螺旋的形成、β片层中链与链之间的结合等。氢键是一个电负性很强的原子（O或N）共价相连的氢原子和相邻的另一个含有孤对电子的电负性强的原子（如O、N或F）之间形成的一种吸引力。氢键的键能为12～30kJ/mol，比共价键弱得多，但由于蛋白质分子中存在许多氢键，所以在维持蛋白质三级结构的稳定性中仍起重要作用。

氢键有两个特征，一个是饱和性，即一个氢供体只能与一个氢受体形成一个氢键；另一个即方向性，即氢键的供体和受体都在同一直线上形成的氢键最强，如两者之间有一角度，氢键就随角度的增大而减弱。

2.离子键

离子键是由带相反电荷的基团通过静电引力形成的，其键能为20kJ/mol，在蛋白质中常被称为盐键或盐桥。在生理pH下，构成多肽链的碱性氨基酸残基侧链带正电，酸性氨基酸残基侧链带负电；另外，游离的N端氨基酸残基的氨基和C端氨基酸残基的羧基也分别带正、负电荷，这些带相反电荷的基团之间可以形成离子键。

3.疏水键

构成蛋白质的非极性氨基酸残基上的各种非极性R基团避开水相，互相聚集在一起而形成的作用力称为疏水作用力，也称疏水键，其键能＜40kJ/mol。在水溶液中它们会躲避周围的极性溶液而自发地聚集在一起，从而在分子内部形成疏水核心。这种疏水相互作用在维持蛋白质的三级结构中起到十分重要的作用。如果一个多肽的所有氨基酸残基都是亲水的，那么用来驱动三级结构形成的力将十分有限；而如果一个多肽既含亲水氨基酸又含疏水氨基酸，则有利于蛋白质在溶液中采取最终的构象状态。

4.范德华力

这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。尽管范德华力十分弱，键能只有0.4～4kJ/mol，但在蛋白质分子中，这样的力大量存在，因此其对蛋白质三级结构的形成作用不容小觑。

5.金属离子的配位结合

金属离子的配位结合只存在于金属蛋白。以羧肽酶A为例，这种由307个氨基酸组成的多肽链大致折叠成球形，这与被结合的Zn2+和其His69、Glu72、His196的侧链以及1个水分子配位结合形成四面体结构有一定关系。

总的来说，维持蛋白质分子三级结构的作用力是次级键，它们的键能虽然弱，但是多个次级键加在一起时，就产生了一种足以维持蛋白质三维结构的强大作用力。另外，绝大多数蛋白质中二硫键对蛋白质的稳定和三级结构的形成也起到相当重要的作用。1963年英国J.Kendrew等测出了第一个蛋白质——抹香鲸肌红蛋白的全部原子的空间结构。抹香鲸肌红蛋白是由一条α螺旋链折叠、盘绕成一个近似球状的三级结构，分子大小约4.5nm×3.5nm×2.5nm，还有一个血红素辅基（图1-35）。

通过对多种球状蛋白质的三维结构研究后发现，虽然每种球状蛋白质都有自己独特的三级结构，但是它们仍有如下共同特征。

（1）含有丰富的二级结构元　纤维蛋白质只含有一种类型的二级结构，而球状蛋白质通常含有几种二级结构。如鸡卵清溶菌酶（图1-36）含有α螺旋、β片层、β转角和无规则卷曲等。当然，不同的球状蛋白质各种元件的含量是不一样的。

（2）具有明显的折叠层次　球状蛋白质具有丰富的结构层次，包括二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构。

（3）分子呈现球状或椭圆状　多肽链折叠中各种二级结构彼此紧密装配，偶尔有水分子大小或稍大的空腔存在，但它仅占构成蛋白质总体积的很小一部分，例如在α-胰凝乳蛋白酶晶体结构中发现只有16个水分子的空隙。值得注意的是邻近活性部位的区域有较大的空间可塑性，允许活性部位的结合基团和催化基团有较大的活动范围。这是酶与底物或调节物相互作用的结构基础。

（4）疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在外表　蛋白质三级折叠的驱动力是引起疏水相互作用的熵效应，折叠的结果是形成热力学上最稳定的三维结构。球状蛋白质分子约80%～90%疏水侧链被埋藏，分子表面主要是亲水侧链，因此，球状蛋白质是水溶性的。

（5）分子表面常常有空穴　这个空穴为配体结合部位（活性中心）。空穴大小能容纳1～2个小分子配体或大分子配体的一部分。空穴的周围分布着许多疏水侧链，为底物等发生化学反应营造了一个疏水环境（低介电区域）。

（二）研究三级结构的方法

测定蛋白质三级结构的方法主要有两种，一种是X射线晶体衍射，另一种是核磁共振影像。两种方法各有利弊。前一种方法首先需要得到蛋白质的晶体，但得到一种蛋白质的晶体并非易事，特别是膜蛋白，某些蛋白质的晶体可能永远无法得到。只有在得到蛋白质晶体以后，才可以进行X射线晶体衍射，但得到的并不是原子的直接图谱，而是电子密度图谱，因此需要傅里叶逆转化去分析电子密度，再还原成三维结构。但典型的蛋白质晶体相对较软，常发生移位，因此它们的电子密度图难以揭示个别原子的准确位置。而且，有些蛋白质只能稳定地存在于溶液中，无法结晶，所以不能应用此方法。核磁共振技术（NMR）则提供了蛋白质在溶液中的结构信息。一些在生物学上十分重要的原子核，例如1H、13C、15N和31P都有特征性的磁矩或自旋。核磁共振仪可以用于分析这些原子核的化学环境并提供有关分子中的原子之间距离的信息。在分析蛋白质的结构时，将此信息与氨基酸的序列、键角、各种基团的平面特征、范德华力等相结合可以解出蛋白质的三维结构。核磁共振技术测蛋白质三维结构可以达到相当于0.25nm X射线晶体结构分析的分辨率。

自从1985年第一个蛋白质的三维结构由NMR法确定以来，已有几百种蛋白质的空间结构通过这种方法得到，约占已被确定空间结构的蛋白质总数的20%。其中有些蛋白质分别被NMR和X射线晶体衍射两种方法测定过。比较它们的溶液结构和晶体结构可以看出二者总体上是相同的，但局部的表面区域由于它们所处的环境不一样而呈现明显的差异，这是因为两种状态下蛋白质分子所处的环境不同而造成的。

七、四级结构

蛋白质的四级结构是指两个或两个以上的具有完整三级结构的多肽链依靠次级键相连，形成特定的空间结构。可以根据蛋白质有无四级结构对其进行分类：仅由一个亚基组成并无四级结构的蛋白质称为单体蛋白质，如核糖核酸酶、胰岛素等；由两个或两个以上亚基组成的蛋白质统称为寡（多）聚蛋白质。寡聚蛋白质只由一种亚基组成，称为同多聚蛋白质，如谷氨酰胺合成酶；由几种不同的亚基组成，称为杂多聚蛋白质，如血红蛋白。

蛋白质的四级结构内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。亚基的表面是不规则的，这使得亚基之间能够结合，成为四级结构形成的基础。亚基之间是否结合不仅与其形状有关，而且与将亚基联系在一起的次级键有关，包括氢键供体对氢键受体、疏水基团对疏水基团、正电荷基团对负电荷基团。这些互补的性质在所有的结合作用中都可以观察到，无论是蛋白质和小分子之间，还是蛋白质和其他大分子之间。

蛋白质四级结构中亚基缔合在结构和功能上具有优越性，主要体现在以下几点。

① 降低比表面积，增加蛋白质的稳定性。

② 提高基因编码的效率和经济性。

③ 使酶的催化基团汇集，提高催化效率。

④ 丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。

⑤ 形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。

⑥ 适当降低溶液渗透压。

⑦ 具有协同效应和别构效应，实现对酶活性的调节。

别构效应指别构蛋白的别构部位与效应物结合改变蛋白质的构象，从而对活性部位所产生的影响。酶的别构效应包括涉及酶与底物结合时催化部位与催化部位之间的相互作用，即同促别构效应（homoteric allosteric effect）；涉及酶与调节物结合时调节部位与活性部位之间的相互作用，即异促别构效应（heterotropic allosteric effect）。

八、蛋白质的结构与功能

蛋白质的性质和生物功能是以其化学组成和结构为基础的。各种蛋白质虽然都是由20种基本氨基酸所组成，但它们分子中的氨基酸种类、排列次序、肽链的多少和大小以及空间结构等各不相同。因此，一种蛋白质的生物功能的表现，不仅需要一定的化学结构，而且需要一定的三维结构。

蛋白质的一级结构与其三维结构具有密切联系。一般来说，具有相似的一级结构通常具有相似的三维结构，但有时非常不同的一级结构（同源相似序列小于20%）能形成相似的三维结构。蛋白质的功能取决于它的三维结构，而三维结构是由其一级结构决定的，蛋白质结构的改变会导致某些疾病的发生。

1.分子病

由于DNA分子核苷酸发生错差，导致蛋白质分子合成异常引起的疾病称为分子病。蛋白质中氨基酸的改变是由于基因突变的结果，所以，分子病是一类基因突变引起的遗传病。镰刀状细胞贫血病是人类认识的第一个分子病。它是一种慢性溶血性贫血，病人的红细胞在氧气不足的情况下变形而呈镰刀状，故由此得名。正常人的红细胞是球状的，而病人血液中相当一部分红细胞是镰刀状（图1-37）。进一步分析镰刀状细胞贫血病病人的红细胞成分，发现其与正常人不同，这种病人红细胞的数量只有正常人一半，血红蛋白的含量也是正常人的一半，对白细胞数量的影响相对小一些。

正常人的血红蛋白（以HbA代表）同镰刀状细胞贫血病病人的血红蛋白（以HbS代表）的生物功能大小悬殊，但在结构上，它们之间的差异仅仅是β链上的一个氨基酸残基，即HbA的β链的第6位为谷氨酸，而HbS的β链的第6位为缬氨酸。

HbA　β链　Val—His—Leu—Thr—Pro—Glu—Glu—Lys…

HbS　β链　Val—His—Leu—Thr—Pro—Val—Glu—Lys…

2.蛋白质构象与疾病

若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。

阮病毒是一种不含有核酸的感染性蛋白质，它们可以引起许多致命的神经退行性疾病。例如流行性海绵状脑病（transmissible spongiform encehapathies，TSE）或叫阮病毒病。阮病毒病可以是遗传性的、感染性的或散在性的疾病。它们主要涉及作为阮病毒的蛋白质的二级结构和三级结构的改变。这一类疾病包括人的早老痴呆病（CJD）、羊的羊瘙痒症、牛的牛海绵状脑病（疯牛病，BSE）。这些疾病的特征改变是由淀粉样原纤维中不溶性蛋白质的沉积引起的海绵状、星型胶质细胞增生和神经元丧失。