第三节　常用的分子技术

一、DNA指纹图谱技术

顾名思义，这是一类通过比较不同品种的独有图谱特征的鉴定技术。物种之间的基因突变，如单一核苷酸多型性（single nucleotide polymorphism，SNP），或序列插入（insertion）等，都可能会引起限制性内切酶的识别点改变。经电泳分离并与荧光或放射性特异性探针杂交后，会获得大小不同的DNA片段信息，与另一样本的DNA图谱比较，可了解它们的相似性。

1.限制性内切酶谱技术

20世纪70年代发展起来的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）在生物学、医学、农学的许多领域都有成功的应用。技术的核心是限制性内切酶（restriction endonuclease）或限制酶（restriction enzyme）。限制性内切酶会在认知位点（recognition site）识别特定碱基序列，并在切割位点（cleavage site）上进行水解消化，将DNA分子切断。认知位点和切割位点可以距离数千碱基，亦可以在相近位置。限制性内切酶共有4种类型，其中第2类型最具应用价值，如Bam HI的认知位点和切割位点：

Bam HI会识别这个由6个碱基组成的序列，并在箭号的位置切断。如果DNA分子上出现了1个认知位点，Bam HI就会将其切断分成两段。如果有2个认知位点便会分成3段，如此类推。而各个片段的大小，是基于各切割位点之间的距离。限制性内切酶的认知位点和切割位点，决定了RFLP图谱上谱带的出现位置和数量。如果不同品种的生物基因组上的限制性内切酶识别位点出现差异，只要将物种的基因组DNA进行酶切消化，然后比较各自酶切图谱，便可作出物种鉴别。

2.随机引物聚合酶链反应（RP-PCR）

随机引物聚合酶链反应（random-primed PCR，RP-PCR）属于指纹图谱类技术。常规PCR中所采用的，是一对特异性高的合成寡核苷酸作引物，而且退火温度尽量提高，多会得到特异性片段。随机引物聚合酶链式反应的引物是任意选择的，而且只会使用单一条引物，退火温度比常规PCR低，反应环境较缓和，通常会得到多条不同分子量的谱带，并以电泳分离，比较样本间图谱差异而作出鉴定。

随机引物聚合酶链反应可细分为2种：①任意引物聚合链式反应（arbitrarily primed-PCR，AP-PCR）（Welsh和McClelland，1990）；②随机扩增的多态性（rapid amplified polymorphic DNA，RAPD）（Williams等，1990）。前者的引物长度介于20～ 30个核苷酸，而后者所用的引物则只有10个核苷酸。

由图2-2可知随机引物聚合酶链反应特点为：①PCR扩增条件不严格，引物与基因组DNA的多个位置发生错配，这些错配位置之间的区域便被扩增；②PCR产物以电泳分离及显影，得出各品种的图谱，作为鉴定依据。

3.直接扩增长度多态性（DALP）

直接扩增长度多态性（direct amplification of length polymorphism，DALP）原理与RP-PCR相似，但反应条件比RP-PCR的条件严格。而DALP比RP-PCR优胜的地方，是能够直接对特异性谱带进行测序。

在RP-PCR中，只会使用单一条引物进行PCR，所以每个谱带的两端都由相同引物所构成，换言之，两端序列是互补的。如果将谱带作为模板直接进行测序，谱带两端都可跟测序引物结合，所以得到的序列有两套讯号，导致无法将序列解读。因此，RP-PCR的谱带必须先经过克隆，然后使用载体本身的通用引物，方可检测序列。

为了简化程序，随即发明了DALP技术（Desmarais等，1998）。DALP的特点在于引物的设计。正向引物称为选择性引物，5’末端为M13通用引物序列，3’末端附加2～ 5个碱基。而反向引物是M13通用反向引物。反应后，所扩增的谱带有3种结果：①两端都是由选择性引物所构成；②两端都是由反向引物所构成；③一端由选择性引物构成，另一端则由反向引物构成。结果①和②都不能进行直接测序，只有结果③才容许。所以，当筛选合适的正反引物组合时，每个组合需要进行2个独立PCR反应。第一个是加入已被放射标记的选择性引物（正向引物），和一个没标记的反向引物。第二个刚好相反，反向引物是已放射标记的，而选择性引物则是没标记的。进行PCR后，将该2个独立PCR的产物进行电泳分离及放射显影，对比2个独立反应的泳道。如果谱带只出现在其中一条泳道，表示该谱带两端都由相同的引物构成。而当谱带均出现在2个泳道之上，代表两端由正和反向引物构成，可直接测序。

例如要区分品种A和品种B，当筛选一个引物组合时，便要对这两个品种各自进行2个独立反应，所以总计是4个反应。经电泳及显影后，首先找出各品种的特异性谱带，即该谱带只会在其中之一个品种出现。其次，该谱带必须要在2个独立DALP反应同时出现，方能直接测序。

由图2-3可知DALP的原理：①在筛选引物时，需要进行两个独立反应。反应1的组合是加入已被放射标记的选择性引物和未被标记的反向引物。反应2刚好相反，反向引物是已被放射标记的，而选择性引物则未被标记的。PCR后，扩增物分别加到泳道1及泳道2进行分离及显影。举例在显影后，谱带A只在泳道1出现，而谱带B则两条泳道出现。原因是②在PCR过程中，谱带A只有正向引物和DNA模板结合，所以两端均是由正向引物构成。在独立反应1（左图），因为正向引物被放射标记，所以谱带在泳道1上会发出讯号。在独立反应2（右图），只有反向引物才被放射标记，相同的DNA区域虽然被PCR扩增（由没有放射标记的选择性引物构成），但因为反向引物并没有构成谱带A，所以泳道2上谱带A的位置没有讯号。因此，当谱带只在其中一条泳道发出讯号时，代表该谱带两端均由相同引物所构成，因此无法进行直接测序。③谱带B的两端分别由正和反向引物构成，所以谱带B在两个泳道都会发出讯号。因此，谱带B可被直接测序。

4.扩增片段长度多态性（AFLP）

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是一种结合RFLP及PCR的指纹图谱技术（Vos等，1995）。优点是不需事先合成引物或设计探针，便能对基因进行分析。跟其他指纹技术不同处在于引物退火温度严格，因此具有高重复性和高分辨率。

AFLP技术主要由3大步骤组成，每一步骤均可将基因指纹图谱的复杂程度降低，有利后面的电泳分离和显像观察，如图2-4。第一步是将样本的总DNA以两种限制性内切酶消化，通常是一个少位点酶（如Eco RⅠ）配合一个多位点酶（如MseⅠ）。消化后的片段小于1000个碱基，所得的片段将会出现3种情况：①片段两端都是少位点酶黏性切口；②片段两端都是多位点酶的黏性切口；③片段一端是少位点酶，而另一端是多位点酶的切口。之后加入连接酶（ligase）和接头（adaptor）。接头其实是经处理的核酸，共分成两部分：一端是预扩增反应引物的互补区，另一端是黏性切口，该黏性接口可以和经内切酶消化的DNA片段连接。在连接反应中，加入两种接头，分别是少位点和多位点酶粘性接头。完成后，部分基因组片段一端接上少位点酶接头，另一端接上多位点酶接头，其余的片段两端都会连接上同一种连接头。

第二步是进行预扩增反应（pre-amplification），所用的一对引物包括3部分：①接头上的互补区；②酶切点；③3’-末端上的一个碱基。预扩增所使用的正向和反向引物，分别跟少位点和多位点酶粘性接头互补。在PCR过程中，只有两端接上不同接头的DNA片段才会被扩增，其余DNA片段因为只会和正向或反向引物结合，所以那些DNA片段将无法扩增。

第三步是进行选择性扩增反应（selective amplification），所用引物在3’-末端会再增加2～ 3个碱基，进一步将图谱复杂度降低，得出具重复性的扩增物。完成后，可以使用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳进行检测，通常会将其中一个选择性扩增引物作放射性标记。由于DNA测序仪越来越普及，最近的研究大多对引物加入荧光标记，利用DNA测序仪直接读出扩增片段的长度。计算所有谱带的大小后，便得出AFLP图谱。

5.聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）

PCR-RFLP是从RFLP技术演变的指纹图谱。传统RFLP多以基因组，线粒体或叶绿体DNA为测试对象。将DNA提纯后加入限制性内切酶进行消化，基因组DNA会被切成多条不同分子量的片段，通过电泳分离，产生专属RFLP图谱。而物种之间的基因突变，可能会引起酶解位的改变，致使RFLP图谱出现差异，通过比较便能将不同物种区分。然而，提取基因组DNA费时，而且所提取的DNA必须完整，否则会影响图谱的准确性及重复性。可惜大部分中药材均经加工处理，令DNA受到不同程度的破坏，所以RFLP未能广泛用于中药材鉴定。PCR-RFLP跟RFLP原理相近，不同之处是前者通过PCR，去扩增某一特定DNA区域来作为酶切的DNA模板。由于经PCR后可以获得大量DNA，而且只分析一小段DNA片段，所以较不受样本DNA质量的影响。

此技术由3个步骤组成，如图2-5，第一步是使用PCR将特定DNA部位扩增，然后纯化。第二步是将纯化后的PCR产物进行酶切，得出酶切后的DNA片段。第三步是使用电泳将大小不同的DNA片段分离，然后染色观察，对比物种间图谱的差异。2015年版《中国药典》收载了以PCR-RFLP鉴定川贝母Fritillaria cirrhosa的技术数据和实验流程，详细列出PCR的条件和所用的限制性内切酶。

6.扩增变异分辨系统（ARMS）

扩增变异分辨系统（amplification refractory mutation system，ARMS）是一种指纹图谱技术，主要用作区分不同种类的等位基因（Newton等，1989）。首先比较各品种的DNA序列，找出它们之间不同的区域，然后设计特异性引物。所设计的引物其3’-末端序列必须是等位基因间相异区域。在PCR过程中，只有当引物的3’-末端序列跟模板序列完全相配（match）时，才可在严格条件下成功扩增。相反，如果引物的3’-末端序列跟模板不相配（mismatch）时，PCR则无法进行，所以没有谱带。反应后，将各品种的PCR产物用电泳分离显影，对比图谱作鉴定。

2015年版《中国药典》收载了以基于ARMS技术鉴定乌梢蛇Zaocys dhumnades和蕲蛇Agkistrodon acutus的PCR鉴别方法，详细列出特异性引物的序列和PCR反应的条件等技术数据和实验流程如图2-6。①设计特异性引物前，需要确定不同等位基因间的差异位置，引物的3’端最后一个碱基，只会跟其中一种等位基因互补配对；②图中显示存在两种等位基因，在严格条件下进行PCR时，只有当特异性引物的3’末端碱基跟模板序列互补时，才可成功扩增；③反应后，将各品种的PCR产物用电泳分离显影，对比图谱作鉴定。

7.序列特异扩增区（SCAR）

序列特异扩增区（sequence characterized amplified region，SCAR）是一种快速指纹图谱鉴定方法。此技术是依赖其他技术如RAPD、AFLP或序列分析所得的结果，从而设计一或多对特异性引物（Paran和Michelmon，1993）。目的是将检测步骤简化，并将扩增谱带数目减少，令对比结果更一目了然。

RAPD及AFLP等技术的优点是能获得大量生物基因讯息，但当要将不同物种的图谱作比对时，往往要借助软件的帮助才能完成，当它们用作快速鉴定时，便显得太复杂。SCAR的原理是借着一或数对特异性的引物，并以严格的条件进行扩增，通过电泳及染色观察。对应的物种会出现一些特异性谱带，而其他物种的谱带则有不同的分子量，甚至是没有扩增物。因此，检验程序快捷，而且结果清晰易明，不需进行数据分析。

设计SCAR特异性引物时，可以从RAPD或AFLP等图谱中找出物种的特异性谱带，对谱带进行DNA测序，或直接比较品种间的DNA条形码，在特异性的位置上设计引物。

SCAR的操作步骤如图2-7：①SCAR特异性引物，可以由其他DNA技术的结果转化而成，例如将指纹图谱上的特异性谱带测序，或将DNA序列排序，找出物种的特异性序列；②根据特异性区域设计SCAR引物；③利用SCAR引物进行PCR，扩增条件严格，最后得出专一的谱带。

8.适配器连接介导的等位基因特异性扩增法（ALM-ASA）

适配器连接介导的等位基因特异性扩增法（ALM-ASA），是针对各类SNP技术限制，而作出改良的一种鉴定法（Wang等，2006），优点是可同一时间检测大量SNP点。

该技术分成5个步骤，如图2-8。品种A和品种B内有2个SNP位，图中的圆形代表酶切识别位，首先第一步进行预扩增PCR，将目标DNA的总量倍增，以便有足够DNA模板进行反应。第二步是加入限制性内切酶（例如MboⅠ），将预扩增片段切成多段两端含有黏性末端的短片段。第三步加入适配器及连接酶，连接酶会将短片段的两端都连上适配器。适配器的其中一端含MboⅠ切口黏性末端，另一端是一长一短的碱基链（称长臂和短臂）。长臂比短臂多出的碱基，其序列跟ALM-ASA通用引物是相同的，所以ALM-ASA通用引物在之后的PCR过程中，不能直接跟长臂结合，只有当长臂的互补区域（即短臂比长臂所缺少的碱基）被伸延后，ALM-ASA通用引物才可与之结合，然后被用作扩增。第四步进行PCR选择性扩增，加入ALM-ASA通用引物和各种特异性引物。特异性引物的3′-末端位于SNP位点，在3’-末端倒数第3个位为一不匹配碱基，用作加强引物的特异性。当进行PCR时，特异性引物只会跟相关的SNP位点融合，然后伸延至配适器的长臂序列。当长臂的互补区域出现后，ALM-ASA通用引物便会跟它互补，然后进行反方向的伸延，所以SNP点与配适器这一段区域便会不断扩增。相反，如果特异性引物未能跟SNP融合，即无法进行PCR。最后一步是以电泳将PCR产物分离及显影，对比由不同品种所产生的图谱。

二、PCR鉴定技术

1.DNA测序和条形码技术

DNA测序（DNA sequencing）泛指可以将DNA序列解读的技术。20世纪70年代前，检测DNA序列非常费劲，每次只可解读5～ 15个碱基。1977年Frederick Sanger、Allan Maxam和Walter Gilbert各自发明了新的DNA测序技术后，检测序列变得更快更容易。

为方便研究，一般在序列差异较大区域的两端，寻找存在于生物之间的保守区域，即不同物种都拥有相同序列的地方。依照这个保守区域的序列，设计通用引物（universal primer），利用PCR技术便可将不同品种生物扩增。扩增区域DNA测序被设限于1000个碱基之下，目的一是减低扩增的难度，二是减少模板DNA质量的影响。通过比对这些特异性DNA区域，可以对未知样本进行物种鉴定。近年来DNA测序经过不断改良创新，又开发了自动测序仪，如果配合碱基荧光标记，测序效率会大大提高。为方便检索、比较及发表各项序列数据，国际上建立了多个基因序列数据库，收录大量数据。

2000年以前，DNA测序技术已相当成熟，但对于应该使用哪一个DNA区域作为鉴定标准还未有共识。虽然数据库中已载有多个生物品种的序列，但因为解读的DNA区域不一，所以无法相互比较。

经DNA测序所解读的序列，除可用作鉴定之外，亦可作为其他DNA技术如SCAR、ARMS、PCR-RFLP等的设计蓝本。将不同品种的序列进行排序，搜寻存在于种间的各个基因突变点、插入点、缺失点，帮助设计特异性引物。亦可利用计算机程序，找出各品种的PCR产物上限制性内切酶位点的相异处而选择合适的酶，简化逐一筛选的工序。

在本书第一章已经介绍的DNA条形码技术不但可应用于生物进化的分子系统学（molecular phylogenetics）研究，也可用于物种鉴定（Dawnay等，2007；Yoo等，2006）。

2.核酸杂交技术

核酸分子在特定情况下（例如加热），其双链之间的氢键和疏水键会因断裂而变成单链，而在条件恢复后（例如降温）又可依碱基配对变回双链结构。如果将两条存有序列差异的核酸分子变性，在分解成单链后混和，就算条件恢复，两者亦会因未能完全互补而无法结合成双链，这现象称为核酸杂交。利用这一原理，便可测试两条序列是否吻合。过去由于技术所限，核酸杂交每次只可检测少量样本。

核酸杂交实验由4个步骤组成，如图2-9。第一步是探针的制备，其序列依受测品核酸碱基配对。用PCR或限制性内切酶将核酸制成特定长度，然后变性，按预定位置转印到芯片之上。第二步是待测品的准备，可用PCR或限制性内切酶将核酸制成特定长度，并加上可被探测的化学分子（如荧光物）。第三步是杂交，当探针和受测核酸相遇，它们会依彼此间序列互补程度进行复性，完全互补的会变回双链，而探针和受测品有差异时，两者未能结合，受测样品便会被缓冲液洗走。最后一步是检测，根据芯片上发出讯号位置，便能得知哪些受测样本和探针序列是吻合的。

3.DNA芯片技术

DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）是一种高通量的检测平台，基本原理也是核酸杂交。芯片技术主要用于基因表达或靶序列鉴定的快速筛选。核苷酸阵列与一般的圆点印记杂交技术相似。它根据DNA双链碱基互补原理，将待测样本DNA或RNA分子与固定在阵列上的已知高密度的DNA探针进行杂交，通过检测探针分子的杂交信号强度，精确识别样本DNA分子的数量和序列信息、甚至样本DNA分子的突变等。它同时快速、灵敏、选择性地检测数以千计的DNA序列。技术突破之处是DNA芯片的制作上利用激光立体化学刻蚀等微加工技术，配合化学合成技术，在芯片上有序地点上数以万计的DNA分子，而这些DNA分子便是传统核酸杂交的单链核酸。因此，在小小一块DNA芯片上，便能同时进行海量的核酸杂交实验，观察基因数据。由于中药材的生物来源极广，此技术正好为高通量鉴定开辟一条新出路。

常规制备一个中密度阵列的方法：第一步，以特异的cDNA或寡核苷酸固化于孔板或膜表面；第二步，将待测的DNA或PCR产物用适当的探针进行标记；第三步，将双链DNA或PCR产物变性成单链；第四步，单链分子与锚定的寡核苷酸进行杂交，结果通过比色法或荧光法检测。如图2-10。

由于常用中药少于1000种，因而开发高密度的中药鉴别基因芯片的必要性不大。不同的物种具有不同的基因组结构，因此，每一物种都会在芯片中产生特异的可供检测的杂交谱带。若要提高基因芯片检测的精确度，则不仅需要开发检测药材的DNA探针，而且还要开发检测其相关品种、代用品及伪品的DNA探针。理论上基因芯片可同时检测复方中所含各种组分的品种基原。

4.等温扩增技术

除了上述由PCR技术作为基础的DNA测序、条形码、芯片鉴定技术外，还有一种新颖的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）用于物种快速鉴定（Notomi等，2000）。LAMP有别于常规PCR，其聚合反应的酶是具有链置换（Strand displacement）能力的Bst DNA聚合酶。其引物也经特别设计，每一个反应会用到6条引物，包括4条特异性引物和2条环引物（loop）。扩增反应可在恒温环境下进行，因此不需要复杂的热循环仪。根据LMAP原理设计了一种实时检视法，当目标DNA与引物结合并进行扩增后，释放出的焦磷酸离子（pyrophosphate ion）与试剂中的镁离子结合，令试剂变成混浊，凭肉眼便能分辨（Moil等，2001）。