第4节　病证效结合研究思路与中药研发的创新

一、病证效结合研究思路与中药复方创新研发实践

中医临床辨证的过程即是分析提取病因病机的过程，是指导立法选方的理论基础。如肝硬化“虚损生积”病机理论的提出，即是长期辨证与求证相结合，不断研究、发展的结果。20世纪70年代，从肝硬化“肝络阻塞、血瘀气滞”的病机认识为始端，走过了临床—实验—再临床反复求证的20余年历程，历经了活血化瘀为主辨证论治—桃红饮活血化瘀—桃仁提取物用于临床治疗的过程。血吸虫病肝纤维化患者接受桃仁提取物治疗后，肿大的肝脾有所缩小、肝血流量及尿羟脯氨酸排泄量增加，为活血化瘀抗肝纤维化的研究带来了希望。活血化瘀及桃仁提取物治疗肝纤维化具有一定“针对性”，但临床患者常见的与机体正气虚损有关的“疲乏”等主要临床表现并未获得显著改善。由此采用虫草菌丝益精补虚，桃仁提取物合虫草菌丝，直至扶正补虚、活血化瘀，研制出有效的抗肝纤维化中药新药扶正化瘀方，不仅可显著改善“疲乏、口干、面色晦黯”等正虚血瘀的临床症状与体征，治疗前后两次活检肝组织学观测表明，扶正化瘀方能有效逆转肝组织纤维化分期的病理变化，部分早期肝硬化也出现组织学上的逆转，可显著改善失代偿期肝硬化患者的肝功能，降低门脉高压、减少食管-胃底静脉曲张破裂出血的发生率。这一研究历程即是辨证分析疾病病机、治疗效应研究验证的过程，促进中医药抗肝纤维化治疗的发展^［25］。

二、病证效结合研究思路与中药创新研发体系的构建

疾病-证候病机理论源于长期、大量的临床观察，数以万计的古代方剂是先人长期临床经验的总结，病证病因病机是择选不同功效方剂的基础，针对现代疾病的病、证、病因、病机发掘古代方剂，是实现“古为今用”的重要发展途径，大量成功的现代疾病动物模型为古方今用的筛选提供了重要技术支撑，而“病证效”结合则可能是实施这一目标的重要思路之一。但需要系统、整体的设计，紧密结合临床处方用药的经验，进行文献古方遴选、模型类方优选、活性物质筛选、整体系统评选。

临床疾病的分类是通过比较（病因或病理学等）而确立的，多数疾病的动物实验研究可以建立可靠的比较参照系统。病证结合动物模型的制备应在疾病模型的基础上，立足该疾病中医临床证候病机的分析结果，以疾病证候病机相对应的不同功效的多种古典方剂为载体，对疾病动物模型进行干预或治疗的比较研究，从病态治疗学角度出发，以整体药效学为基础，研究其相应显效方剂作用的疾病病态基础，分析探讨疾病与其“方证”病理的关系。

病的同一性及其同病证候病机或不同阶段病理状态的差异性，是对疾病进行不同治法方药比较的基础；重要的问题是如何解决疾病证候病机的复杂性、动态性（或疾病病理状态的多样性、动态性）与疾病动物模型局限性之间的矛盾。其要点是解决空间上的“多”与时间上的“动”。前者可借用不同造模因子所致不同发病机制的同一疾病的多种模型进行，即在既定疾病病态进行比较，能使我们区分和认证同一疾病模型的不同病理状态；时间上的比较即疾病病理过程的动态比较，使我们能够进一步发现同一疾病模型不同阶段的病态变化。紧密结合方剂的干预或治疗，进行这两方面比较将有助于我们发现显效方剂方证的病理生物学基础。

基于临床疾病的中医证候病机或基本证候类型，紧密结合常用药物与中医古籍中有关内容，选择有代表性、可资比较的相应功效的古典方剂；采用国际同行认可的、可以参比的同一疾病多种病理模型，进行不同功效方剂比较（包括对同一病理模型不同病理状态的动态对照观察）研究，以期获得可靠的比较证据，从病态治疗学角度进行疾病中医方证相关性的实验性探索，以期由此提取出针对疾病不同证候病机相关方剂治疗同一疾病取效的不同作用机制及其病理状态。如针对类风湿关节炎不同证候的6种方剂，在胶原免疫性关节炎动物模型中显示各自有作用特点的药效机制，补肾祛风法主要表现为修复骨质损伤；宣发膜原法主要表现为调节辅助性T细胞（helper T cell）Th1和Th2免疫反应的不平衡；补脾祛湿法主要表现为调节免疫；通络化瘀法主要为调节细胞因子的节律；调和营卫法重点则是调节黏膜免疫；清热解毒法主要表现为免疫抑制。在此基础上，提出了中药治疗类风湿关节炎药效学规范^［26］。

基于现代疾病不同病种的中医临床主要证候病机及与疾病相关的中医病名，建立包括方剂资源库、中药数据库、病证数据库、治法数据库、病案数据库与专家知识库；建成能为专病有效方药筛选与合理配伍提供相关文献与临床证据支持的分析系统，筛选出针对疾病临床主要证候病机及相关中医病证的多种不同功效的古典方剂，基于临床，溯源文献，遴选古方。

基于中医对疾病临床证候病机的共识以及“病-方（证）-效”的研究设计思路，采用一种疾病不同造模方法制备的多种模型、同种模型不同阶段（动态观察）进行多种不同功效方剂的比较观察；实验指标与整体状态、组织病理与功能相结合，进行整体、动态的综合效应评价。在明确证实相应功效方剂具有综合效应病理模型的前提下，再采用该模型进行同类功效的多种方剂的评价，可进一步筛选出同类功效方剂中具有相对特异性的有效方剂。

选择对整体模型确有治疗效应的方剂，进行全方及其组成药物的不同部位、组分的提取分离。针对疾病的主要病理（如炎症、免疫、损伤修复）机制，采用高通量、高内涵（多靶点）、多环节、多层次（分子、细胞）等综合筛选方法，进行全方与单味中药的部位与组分的评价与筛选。并基于活性部位、组分的筛选结果，进一步开展成分的分离制备，药效追踪并发现活性成分。

基于整体模型不同功效方剂及中药组分的体外综合筛选结果，开展适合中药多组分与少剂量水平特点的组方的定量设计研究，建立方剂活性组分配伍的分析判识模型，获得组分配伍的设计方案。

根据中药成分的体外筛选结果，开展基于“分子垂钓”理论预测和核磁共振观察技术进行中药活性成分的靶点筛选和确证的研究，可确认先导化合物。

采用整体模型的药效与基因组、转录组、蛋白质组、代谢组相结合的综合评价方法，开展中药组分及其配伍或有效成分整体效应的研究，同时进行相关作用机制的分析研究。

三、病证结合中药复方效应基础研究与理论发展

一些有效的经方、成方的配伍也大都有其鲜明的特点和中医理论基础，多为中医学理论精华和长期临床经验密切结合融汇集积而成，与其特定的证候（即“方证”）有较明确的对应关系；采用证候例方进行干预或治疗性试验，以药效为基础（包括动物整体状态），利用现代系统生物学的整体思路，研究和评价机体的基因、蛋白质、细胞、组织器官等层次的结构和功能改变，可为揭示相关方证的病态实质提供有价值的资料。

根据肝炎后肝硬化中医证候临床流行病学调查的分析结果，结合现代相关文献的分析，确立肝硬化的主要证候病机；基于方证相应的基本原则，结合现代临床用药经验，选择针对疾病主要证候病机的相应功效且具有代表性的古典方剂（益气的黄芪汤、祛瘀的下瘀血汤、滋肾养肝的一贯煎及清热利湿的茵陈蒿汤）；采用不同造模因子制备的肝硬化多种经典动物模型（二甲基亚硝胺，dimethylnitrosamine，DMN；四氯化碳，carbon tetrachloride，CCl₄；胆管结扎，bile duct ligation，BDL；异种血清免疫损伤等），分别以多个不同功效方剂进行同期干预治疗的比较研究，以肝脏病理组织学、肝功能评价其不同功效方剂的干预治疗效应；以药效为基础，通过肝组织基因组、蛋白质组表达变化的对照观察，分析显效方剂相应模型动物或病理阶段的基因、蛋白质表达的差异；结合显效方剂效应动物模型的病理变化，深入研究显效方剂的作用机制及效应基础，综合分析、归纳显效方剂相应的方证病态特征。

明确给药干预的时间点在模型动物已形成肝纤维化并向肝硬化发展的阶段予继续造模因子刺激的同时，给予不同功效方剂的干预治疗，DMN大鼠模型于造模第3周首日开始给药至4周末；CCl₄大鼠模型（12周模型）于造模第9周首日开始给药至12周末（或9周模型于造模第7周首日开始给药至9周末）；胆管结扎大鼠于手术结扎胆管第2周首日开始给药至5周末；猪血清免疫性大鼠模型于造模第9周首日开始给药至12周；同时设DMN造模4周终止造模因子刺激后给药治疗2周；以肝组织学及其羟脯氨酸含量为主要指标，结合肝功能变化，判断方剂的疗效。

基因芯片与蛋白质组学技术分析显效方剂的作用特点采用基因芯片及固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）2-DE技术分离肝组织总蛋白质，经考马斯亮蓝染色，ImageMaster图像分析，识别差异表达的蛋白质，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱技术（matrix-assisted laser desorption /ionization time of fl ight mass，MALDI-TOF/TOF-MS）和数据库搜索鉴定蛋白质。分析显效方剂的差异表达基因与蛋白，在此基础上，结合肝纤维化、肝硬化病理生物学的研究进展，对不同造模方法大鼠模型显效方剂作用机制进行深入研究，分析显效方剂的效应基础，提取凝练不同功效方剂“方证相应”证候病机的病理生物学基本内涵。

通过显效方剂相应模型病理变化与方剂疗效机理的研究，提出了肝硬化病证相关证候病机的主要病理特征。气虚主要表现为肝星状细胞的活化及胆管上皮细胞向肌成纤维样细胞的转分化；纤维组织的异常沉积与血管生成为血瘀的主要病理变化；肝肾阴虚体现在肝实质细胞的衰减、蛋白质代谢异常及肝窦内皮细胞的损伤；湿热是以库普弗细胞（Kupffer Cell，KC）活化为主体的炎症反应及脂肪酸代谢异常。为中医益气方药抑制细胞的异常分化以及养阴方药抗组织实质细胞损伤的深入研究和应用提供了重要发展方向。

对部分显效方剂进行组分、成分分离的效应跟踪研究，发现显效方剂的物质基础及配伍作用机制。通过有效方剂的组分、成分对效应模型的跟踪研究，发现黄芪汤组分、成分（黄芪总苷与甘草酸）配伍的效应物质基础及主要作用机制。

在DMN造模第3周开始给予不同方剂灌胃并继续造模因素刺激至4周末，4个不同功效方剂中仅有清热利湿的茵陈蒿汤呈现显著疗效，模型对照大鼠12只中有9只形成肝硬化（75%），茵陈蒿汤干预组12只大鼠仅1只见到完整的假小叶（肝硬化形成率为8.3%），而其他3个方剂的组织学评价与模型对照组间均无显著性差异；对于已造模成型的DMN大鼠肝硬化（造模4周后并终止造模因素刺激后给予不同方剂2周至6周末），不仅茵陈蒿汤具有显著疗效，益气的黄芪汤也呈现出显著的治疗效应^{［27，28］}。

CCl₄-12周造模制备大鼠肝硬化，第9周开始用药并继续造模因素刺激至12周末。模型对照组80%形成肝硬化，用药组肝硬化的形成率分别为：一贯煎组11.1%、下瘀血汤组22.9%、黄芪汤组33.3%、茵陈蒿汤组40%、小柴胡汤组62.5%，肝功能、肝组织病理改善及肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量的降低均是以下瘀血汤和一贯煎为显著，下瘀血汤降低Hyp含量最佳，一贯煎提高血清白蛋白（albumin，Alb）含量尤著；益气的黄芪汤也有显著降低肝组织Hyp含量的作用。CCl₄-9周模型于造模6周后开始给药至9周末（用药3周）的结果与其一致^{［29，30］}。

Wistar大鼠腹腔注射猪血清，12周制备肝硬化模型，造模8周后于第9周开始分组经口给予不同方剂并继续造模至12周末。结果下瘀血汤可改善肝组织病理变化、显著降低肝组织Hyp含量，其他3个方剂均无显著作用^［31］。

远近端结扎后剪断胆总管，造模1周后分组经口给予不同方剂至5周末（给药4周），结果表明，黄芪汤、茵陈蒿汤可显著改善肝功能及肝组织病理变化，显著降低肝组织Hyp含量，以黄芪汤的效应为优；其他方剂无明显作用^［32］。

表明DMN与CCl₄两种模型的中医方证效应恰好相反，且均经重复验证，为深入研究不同方证的病理特点奠定了基础。

以综合药效学为基础，紧密围绕肝纤维化、肝硬化病理生物学机制的研究进展，结合基因芯片与蛋白质组学技术，系统阐释病证相关、方证相应的效应基础。明确黄芪汤益气作用主要表现为抑制致纤维化的关键细胞因子——转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β₁的基因表达及蛋白生成、肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化以及肝内细胞的异常转分化（肝细胞→胆管上皮细胞→肌成纤维样细胞）；下瘀血汤祛瘀效应主要体现在抑制肝内血管的异常增生以及促进胶原降解。可以透视出肝纤维化、肝硬化的核心病理变化与中医基本病机的内在关系。

DMN大鼠肝硬化基因芯片分析提示，肝组织中与肌动蛋白合成相关基因的显著下调是黄芪汤抑制α-SMA蛋白表达的作用因素。黄芪汤组有注释的特征性差异表达基因共6个，主要涉及肝星状细胞活化、生物转化等。转凝蛋白（transgelin，Tagln，又名SM22）是一种参与肌动蛋白交联的蛋白，在肝星状细胞肌动蛋白细胞骨架的形成中发挥重要作用。PDZ and LIM domain 3是与α-辅肌动蛋白2结合的辅助因子，研究表明含LIM 域的蛋白C反应蛋白2（C-reaction protein，CRP2）可能是肝星状细胞活化的一个新标志物，黄芪汤可显著下调这2个基因的表达。而胞质乙酰辅酶A水解酶（cytosolic acetyl-CoA hydrolase，CACH）属于参与第一相反应的胞液水解酶类，在药物代谢与解毒过程中具有重要作用，黄芪汤可以显著提高其表达量。

对肝纤维化进展期DMN模型大鼠（第3周开始干预），黄芪汤综合药效虽不显著，但是能显著抑制肝组织TGF-β₁基因及蛋白表达、提高肝细胞生长因子-α（hepatocyte growth factor-α，HGF-α）蛋白表达。显著抑制BDL大鼠胆管上皮细胞TGF-β₁（茵陈蒿汤无作用）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的表达量^［33］。黄芪汤组分可有效干预治疗继发性胆汁淤积性肝纤维化，其作用机制主要在于保护肝细胞，抑制BDL后肝细胞自分泌TGF-β₁这一重要始动环节，进而抑制肝细胞向胆管上皮细胞转分化以及向肌成纤维样细胞的转分化；此外，黄芪汤组分可抑制BDL大鼠肝纤维化形成过程中肝星状细胞的活化^{［34，35］}。

对于DMN大鼠肝硬化，黄芪汤对模型组有显著调节作用的蛋白质主要涉及细胞分化（转录调节因子1-β、脑脂结合蛋白）、神经传导（γ-氨基丁酸受体ρ2亚基、儿茶酚邻甲基转移酶抑制剂）、细胞骨架（原肌球蛋白4、原肌球蛋白5、γ肌动蛋白、细胞角蛋白18）、脂糖代谢（促肥大反应蛋白、半乳糖激酶1、果糖-1，6-二磷酸酶1）、氧化应激（谷胱甘肽S-转移酶Yb-1亚基、DJ-1蛋白、铜/锌超氧化物歧化酶）等功能^［36］。DMN-4周模型大鼠表达显著下降，而黄芪汤组表达进一步显著下调的蛋白质有唐氏综合征临界区域基因1-1蛋白、神经肿瘤抗原-1；这与茵陈蒿汤的效应形成较为鲜明的对比，RCAN1是诸多组织细胞生长和内质网应激信号通路的调节者，主要与调控细胞生长发育有关。这一结果表明，黄芪汤对该模型的细胞异常增殖与凋亡并无显著的影响，但该方却能显著上调转录调节因子1-β的表达，转录调节因子1-β参与了细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤转移、形态发生、精细胞发育、胚胎早期发育等许多重要生理过程的调控，结合该方显著下调原肌球蛋白4、原肌球蛋白5、γ肌动蛋白、细胞角蛋白18、γ-氨基丁酸受体ρ2亚基等的作用，提示影响该模型肝内细胞的异常分化可能是黄芪汤的重要作用途径。BDL肝硬化大鼠随着造模时间的延长，肝组织α-SMA、TGF-β₁、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3、p-Smad3、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达逐渐增加，黄芪汤干预组上述蛋白表达均显著降低^［37］。

采用DMN模型，黄芪汤组分于肝纤维化进展期（第3周开始至4周末）进行干预。根据均匀设计方案选用U₈*（8⁵）表，将黄芪汤四种中药组分（X1、X2、X3、X4）作为考察因子，每个因子分别取8个水平，按照均匀设计表格分为8组。综合分析肝组织学与肝组织Hyp含量以及肝功能变化，并将8个用药组的所有标化值利用DAS 2.0，SAS 9.1.3的多元回归程序，对8个用药组的所有观测值针对不同的指标进行多元线性回归（自变量的筛选方法采用逐步回归法）处理。发现黄芪组分与甘草成分的抗肝纤维化效应的最佳配伍比例，并在正交试验中得到验证。为进一步研究作用机制及其应用奠定了基础^［38］。

调控基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）/组织基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）蛋白和基因表达，促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解是下瘀血汤有效干预治疗猪血清免疫损伤性大鼠肝硬化的作用机制之一。下瘀血汤破血逐瘀的作用特点表现在降解过度沉积的ECM；调节机体免疫反应，抑制HSCs活化，调控KCs功能，调控MMPs/TIMPs蛋白和基因表达，促进ECM降解^［36］。

通过复制CCl₄模型，比较观察一贯煎、下瘀血汤、黄芪汤等养阴、活血、益气不同功效方剂对肝组织血管生成的作用，结果表明，一贯煎与下瘀血汤可明显抑制肝组织血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）、第八因子相关抗原（von Willebrand factor，vWF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial grow factor，VEGF）和血管内皮生长因子受体（vascular endothelial grow factor receptor，VEGFR）2等的表达，抑制肝组织血管生成；下瘀血汤作用更为显著，两者的作用机制明显不同，下瘀血汤主要在于抑制活化的HSCs、下调MMP-2的活性，消解新生血管完整性的保护机制；一贯煎主要在于改善低氧环境（抑制缺氧诱导因子1，见后），保护肝细胞，调节肝脏代谢功能^［39］。

基因芯片分析提示，下瘀血汤的作用机制与调节钙稳态、提高机体抗氧化损伤能力及抑制肝细胞异常增殖有关。

肝组织蛋白质组表达谱部分蛋白质分析结果显示，降低补体衰变加速因子（complement decay accelerating factor，DAF）、肝内加帽蛋白、丝裂原活化蛋白激酶激活物结合蛋白、26S蛋白酶调节亚基6A、翻译控制肿瘤蛋白1、促进热反应蛋白12的表达是下瘀血汤调控细胞的异常增殖与凋亡以及改善代谢异常，减缓肝纤维化进程的作用途径之一。

一贯煎组特征性上调的基因为：精氨酸垂体后叶素受体1A（arginine vasopressin receptor 1A，AVPR1A）、细胞色素P450家族3亚家族a多肽13（cytochrome P450，family 3，subfamily a，polypeptide 13，CYP3A13）、β球蛋白（Betaglo）；特征性下调的基因为：淋巴毒素A（lymphotoxin A，LTA）、基质金属蛋白酶-23（matrix metalloproteinase 23，MMP-23）、RNA 结合基序蛋白3（RNA binding motif protein 3，RBM3）、血小板反应蛋白2（thrombospondin 2，TSP2）^［40］。

抗氧化应激及线粒体损伤、调控肝内细胞的生长、发育及异常分化与血管新生，可能是一贯煎抑制CCl₄大鼠肝硬化的效应基础。一贯煎促进肝内转录调节因子1-β，唐氏综合征临界区域基因1-1蛋白，神经肿瘤抗原1，DJ-1蛋白，磺基转移酶1C1，Cu/Zn-SOD、二甲基精氨酸二甲胺水解酶1（dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1，DDAH1）、α-2u-球蛋白，抑制γ-氨基丁酸受体ρ2亚基、翻译调节肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein，TCTP）、CK8、CK18的表达^［41］。

抑制HOC向肌成纤维样细胞的分化，一贯煎可以改善骨髓移植CCl₄肝纤维化，抑制骨髓细胞向肌成纤维细胞分化；通过提高Cu/Zn-SOD蛋白表达而降低肝组织缺氧诱导因子1，抑制CCl₄肝硬化大鼠肝脏血管生成^［42］。

基于一贯煎为干预CCl₄大鼠肝硬化的有效方剂，进一步进行同类方剂的比较研究。结果表明：同为养阴类方剂的六味地黄丸具有降低CCl₄肝纤维化大鼠血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性的效应，具有一定地改善肝组织病理变化，降低肝组织Hyp含量的趋势（无显著性差异）。显示六味地黄丸和一贯煎对该模型干预效应有一定的“趋同性”，但一贯煎的整体效应尤其是提高Afamin mRNA表达及血清白蛋白的含量显著优于六味地黄丸。两方的效应差异显示出其“方证基础”的相对特异性及“以方测证”的实证性^［29］。

正常大鼠肝组织CD68阳性KCs表达较少，在肝窦和汇管区有少量的分布，DMN造模4周，CD68阳性KCs仍呈高表达状态，汇管区和纤维间隔附近有较小的、致密的CD68阳染，呈片状分布。茵陈蒿汤显著降低纤维间隔内CD68阳染，肝窦、汇管区CD68分布较均匀，无片状集中分布。与模型组相比，一贯煎对CD68染色有一定的减弱作用，阳染主要分布在纤维间隔，肝窦表达相对较少。

与免疫组化染色结果类似，免疫印迹结果表明：与正常组相比，模型组CD68蛋白表达显著升高，茵陈蒿汤和一贯煎均可以显著降低CD68蛋白表达，茵陈蒿汤显著抑制TNF-α蛋白表达，然而一贯煎显著促进TNF-α蛋白表达^［34］。

基因芯片检测及分析结果显示，茵陈蒿汤可能通过上调Ras鸟苷酸释放蛋白4（RAS guanyl releasing protein 4，Rasgrp4）而上调PPAR-γ的表达，上调肿瘤抑制基因Rassf4基因而减少DMN肝硬化大鼠肝内病理性凋亡和异常增生。下调胶原Col5α2与Col18α1的基因表达^［43］。蛋白质组学部分蛋白质谱变化提示，在4周模型组表达显著下降，而茵陈蒿汤组表达显著上调的蛋白质有：①抑制细胞增殖蛋白：热反应蛋白12；②神经发育相关的蛋白：唐氏综合征临界区域基因1-1蛋白、神经肿瘤抗原-1；③氨基酸代谢酶类：支链酮酸脱氢酶E1、精胺脲水解酶、亮氨酸氨基肽酶；④物质转运蛋白：α-2u球蛋白；⑤生物转化酶类：D-多巴色素异构酶。在4周模型组中表达显著增加，而茵陈蒿汤组表达显著下调的蛋白质有：基因表达调控蛋白、翻译延伸因子。在4周模型组表达增加，茵陈蒿汤组表达进一步显著上调的蛋白质有：①细胞骨架类蛋白，细胞角蛋白8；②促细胞增殖蛋白，翻译控制肿瘤蛋白1。

茵陈蒿汤能显著提高DMN大鼠肝硬化肝组织HO1 mRNA及蛋白的表达，提高SOD、HSP70、转铁蛋白及L-脂肪酸结合蛋白的含量，降低MDA以及Fas、Bcl-2以及Caspase-3蛋白与活性的表达^［35］。

对于BDL大鼠肝硬化，激光微切割胆管上皮细胞检测其mRNA显示，其主要特点是抑制PDGF-B mRNA的表达，从而可抑制HSC的增殖，这与黄芪汤的作用特点明显不同。

通过显效方剂相应模型病理变化与方剂疗效机制的研究，立足于方证相应的基本原则，提出了肝硬化病证相关证候病机的主要病理特征，湿热与阴虚是肝硬化疾病具有特征性的中医证候病机，气虚血瘀为肝硬化的基本病机（在疾病不同阶段具有程度上的差异），与临床证候病机的分类结果具有良好的一致性。为基于疾病临床证候病机进行“病-方（效）-证”基础实验研究提供了可行性范例，为发掘“古方新用”开拓了新途径。

研究结果一定程度上实现了中医病机与现代疾病病理生物学在其基本概念上的沟通与对接。气虚表现为肝星状细胞的活化（逆分化）及肝细胞、胆管上皮细胞向肌成纤维样细胞的转分化（细胞形质及功能变化），肝肾阴虚体现在肝实质细胞的衰减、蛋白质代谢异常及肝窦内皮细胞的损伤（细胞形质损伤），而纤维组织的异常沉积与血管生成为血瘀的主要病理变化，湿热是以库普弗细胞活化为主体的炎症反应及脂肪酸代谢异常。