任务实施

操作1　微生物形态镜检观察

一、目的要求

1.了解显微镜的构造及成像原理

2.熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等微生物的基本形态结构

二、显微镜的构造

显微镜的构造见54页。

注：显微镜的总放大倍数=物镜放大倍数×目镜放大倍数

三、仪器与试剂

1.实验器材

普通光学显微镜、擦镜纸、标本片（细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等）。

2.实验试剂

二甲苯、香柏油。

四、实验步骤

显微镜的使用方法主要包括7步：

1.准备工作

小心取出显微镜，镜臂正对操作人员，放于离桌边5～10cm的位置。凳子的高低调至合适，并保持显微镜不倾斜。

2.调节光源

将低倍物镜与目镜正确组合，通过目镜观看同时调节光源强度至最佳。

3.放置标本

下降载物台，用玻片夹固定玻片标本，并移动菌样至通光孔中央位置。

4.低倍物镜观察

通过缓慢转动粗准焦螺旋，使低倍物镜镜头下端接近于玻片，同时用眼观察找到图像“闪烁点”，立刻更换细准焦螺旋前后转动，直至找到清晰图像为止。

5.高倍物镜观察

低倍物镜下，调整图像位置于视野中央（即目镜指针针尖处），接下来转动转换器至高倍物镜正确位置（伴有“咔嚓”声），最后微调细准焦螺旋即可获得清晰图像。

6.油镜观察

首先下降载物台约2cm，将油镜转至正确位置，接下来在标本片镜检部位滴加香柏油一滴，从侧面观察，将油镜镜头浸入香柏油中，最后目镜观察调节合适光线强度，用粗、细准焦螺旋找到清晰图像，并绘制视野图像标注样品名称和放大倍数。

7.观察完毕，显微镜清洁还原

油镜镜头清洁要用三张擦镜纸。第一张擦镜纸拭去镜头上的香柏油，第二张擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头上残留的油迹，第三张擦镜纸擦去残留的二甲苯。另外，可用柔软的绸布擦拭显微镜的金属部件。显微镜还原主要包括关闭电源、物镜转成“八”字形、载物台下降、加盖防尘罩并归位等操作。

五、数据记录与处理

绘制标本片的视野图。

六、操作注意事项

（1）取放载玻片，要先下降载物台，再取放。

（2）不要用手触摸显微镜光学部件，保持光学系统表面清洁。

（3）使用细准焦螺旋微调时，如遇到不能继续向同一方向转动时，应立刻向相反方向转动准焦螺旋。

（4）使用高倍物镜时，由于物镜与标本之间距离很近，要特别小心，以免损坏物镜镜头。

任务评价

思考与交流

1.显微镜最重要部件是什么？

2.如何正确使用显微镜？

3.如何正确处理有污物的物镜镜头？

操作2　水浸标本片制作

一、目的要求

1.掌握水浸标本片的制作过程

2.熟悉简单染色方法

二、方法原理

水浸标本的制作技术是研究微生物的一种主要方法。大多数的微生物由于个体微小，肉眼不适合观察；另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小呈现无色，即使光线可透过，也难以辨明。但在经过固定、染色、包埋等处理后就可把材料做成较薄的水浸片，可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成分含量的变化，在显微镜下即可清楚地看到其中不同的区域组分状态。

三、仪器与试剂

1.实验器材

普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、吸水纸、镊子、酒精灯等。

2.实验试剂

生理盐水、吕氏碱性美蓝或齐氏石炭酸复红染液。

3.实验材料

细菌平板或细菌斜面。

四、实验步骤

（1）擦拭载玻片和盖玻片　将清洗好的载玻片和盖玻片用清洁的纱布擦干。其方法是擦拭载玻片时，左手拇指和食指夹着其短边的边缘，右手拇指和食指持清洁的纱布沿长边往返，在上下两面同时轻轻擦拭。擦拭盖玻片，方法与载玻片相似，但要先持两对边擦拭后，再旋转90°持另两对边进行二次擦拭。

（2）在擦拭好的载玻片正中央加滴一滴生理盐水。

（3）用灭菌的接种环挑取菌样，均匀涂抹在载玻片中间的生理盐水中，然后滴加染色剂进行染色。

（4）用镊子夹住盖玻片一边，将另一边放入载玻片水滴中，使盖玻片倾斜，来回拖拉一次，然后慢慢地放下另一边，轻轻抽出镊子，并用吸水纸把多余的蒸馏水吸干，水浸标本片制作完成。

（5）将标本片置于显微镜观察，并绘制视野图像。

五、数据记录与处理

绘制水浸标本片的视野图。

六、操作注意事项

（1）擦拭载玻片和盖玻片，一手用食指和拇指轻轻夹住载玻片的边缘，另一只手拿纱布将载玻片放在两层纱布之间，用食指和拇指夹住轻轻擦拭，用力要均匀。此外，由于盖玻片小而薄，擦拭时必须小心。

（2）用滴管在载玻片中央滴加蒸馏水要适量，水滴太小容易产生气泡或干涸影响观察，水滴太大容易溢出载玻片而污染物镜镜头。

（3）接种环挑取菌样要少许，涂抹要均匀，过多的菌样反而影响观察结果。

（4）加盖盖玻片要熟练，防止出现气泡。

任务评价

思考与交流

1.如何清洁载玻片和盖玻片？

2.如何加盖盖玻片才不会产生气泡？

3.为什么制作水浸标本片时不要挑取过多菌样？

操作3　常用染色技术

一、目的要求

1.掌握简单染色的步骤

2.掌握革兰氏染色法的步骤和关键点

3.学会识别细菌的革兰氏染色结果

4.了解无菌操作技术

二、方法原理

（一）简单染色

利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。常用的微生物细胞染料分为碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括酸性复红、伊红及刚果红等。简单染色以碱性染料进行，原因是微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色，有利于观察。

（二）革兰氏染色

革兰氏染色与细菌细胞壁结构有密切关系。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫-碘的紫色复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂多糖含量高，经乙醇处理后部分细胞壁可被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大，因而结晶紫-碘紫色的复合物容易被洗脱至无色。再经沙黄复染后，镜检结果为革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

三、仪器与试剂

1.实验器材

普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、吸水纸、镊子、酒精灯等。

2.实验试剂

蒸馏水、生理盐水、吕氏碱性美蓝溶液、草酸铵结晶紫溶液、革兰氏碘液、95%乙醇、沙黄染液。

3.实验材料

枯草芽孢杆菌斜面、金黄色葡萄球菌斜面、大肠杆菌斜面。

四、测定步骤

（一）简单染色

1.涂片

取一块载玻片，滴一滴生理盐水于中央，用接种环按无菌操作要求挑取少许枯草芽孢杆菌于载玻片上的生理盐水中，涂抹均匀。按上述操作也可制作大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等涂片。

2.干燥

自然干燥或用电吹风干燥。

3.固定

涂菌面朝上，通过酒精灯外焰往返移动3～5次。

4.染色

将载玻片平放于载玻片支架上，滴加吕氏碱性美蓝染液于涂菌部位进行染色，时间1～2min。

5.水洗

染色完毕后进行蒸馏水冲洗，可用吸水纸吸去多余水分，并自然干燥或电吹风吹干。

6.镜检

将制备好的样品置于显微镜下观察，记录。

（二）革兰氏染色

1.涂片

在载玻片中央滴一滴无菌生理盐水，用灭菌的接种环挑取菌样（菌样可为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）在生理盐水中涂成薄层，并进行干燥。

2.固定

用镊子夹住载玻片一端，菌样面朝上，在酒精灯外焰往返移动3～5次。待冷却后染色。

3.初染

滴加草酸铵结晶紫染液，染色1min，水洗。

4.媒染

滴加革兰氏碘液，染色1min，水洗。

5.脱色

滴加95%乙醇脱色约15～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

6.复染

滴加沙黄复染液，复染1min，水洗、干燥。

7.镜检

使用显微镜油镜镜检观察。

五、数据记录与处理

绘制出各种染色后的视野图。

六、操作注意事项

（1）选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。

（2）涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。

（3）脱色是革兰氏染色的关键步骤，脱色不够易造成假阳性，脱色过度易造成假阴性。

任务评价

思考与交流

1.染色过程中如何实现固定操作？

2.简单染色为什么要用碱性染色剂？

3.革兰氏染色的步骤是什么？关键操作是哪一步？

操作4　菌落形态观察

一、目的要求

1.了解细菌、放线菌、酵母菌、霉菌四类微生物的菌落形态特征

2.掌握常见微生物菌落的特征描述

二、方法原理

依据微生物菌落形态要点完成菌落描述。

三、仪器与试剂

1.实验器材

恒温培养箱、培养皿、酒精灯、接种环等。

2.实验试剂

营养琼脂培养基、高氏一号培养基、PDA培养基。

3.实验材料

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、酿酒酵母、啤酒酵母、根霉、曲霉、青霉、毛霉等。

四、实验步骤

菌落特征观察内容：

1.菌落形态

主要包括形状、透明度、边缘状况等。

2.大小

描述菌落大小。

3.表面状况及隆起度

主要包括菌落表面湿润情况、黏稠度、隆起度、厚度、孢子状态等。

4.质地

菌落的致密或疏松情况。

5.培养基上蔓延程度

观察菌落在固体培养基上的生长延伸情况。

6.与培养基结合程度

主要指菌落与培养基结合的牢固或松软，是否容易挑取。

7.颜色

要从正面、背面、边缘、中心等多方面描述菌落的颜色，同时注意不同方面的色差情况。

8.气味

通过嗅觉来判断菌落散发的气味。

最后，根据观察正确描述各类微生物菌落特征，填写记录表。

五、数据记录与处理

六、操作注意事项

菌落形态要观察仔细、详尽，菌落特征描述要规范、准确、科学。

任务评价

思考与交流

1.为什么菌落正反面颜色会出现色差？

2.描述菌落特征时，主要从哪些方面入手？

3.试比较一下放线菌与霉菌的菌落特征、细菌与酵母菌的菌落特征。