2.3.2　化学制药工艺的小试研究

2.3.2.1　小试的研究内容

在确定一条药物的合成工艺路线之后，首先需在实验室规模条件下对所选路线进行验证、考察和初步的工艺优化。而在一般的有机化学合成路线研究中，往往对新的试剂、新的方法较为关注，在新药研发的前期也是以快速地得到结构类型尽量多的化合物供生物活性筛选为主要目的。这些研究在产品收率及操作的简便性、合理性等方面一般都未作深入的研究和优化，例如柱色谱在这些研究中非常常见，但在化学制药的工业化生产过程中则由于成本和效率的原因而非常少见，往往采用重结晶、精馏等方法来进行代替。所以在化学制药工艺的小试研究阶段即要有工业化和工程化的概念。

影响一个合成反应结果的因素有很多，大致可分为内因和外因两个方面。内因即参与反应的分子中原子的结合状态、键的性质、立体结构、功能基活性、各种原子和功能基之间的相互影响及理化性质等；外因即反应的外部条件，也就是各种化学反应单元在实际生产中的一些共同的问题，包括配料比、反应物的浓度与纯度、加料次序、反应时间、反应温度与压力、溶剂、催化剂、pH值、设备条件、反应终点控制、产物分离与精制、产品质量监控等。

在药物的工艺路线确定以后，反应的基本类型、所需的原料、所经过的中间体也完全确定下来，即反应的内因已确定下来。要使反应的结果达到最佳就必须对以上的外因进行研究和优化，这也成为不同阶段工艺研究的重点内容。总的来讲，只有对化学反应的内因和外因以及它们之间的相互关系深入了解之后，才可能正确地将两者统一起来考虑，才有可能获得最佳的工艺条件。所以良好的有机化学、药物合成反应、物理化学等基本知识对药物工艺路线的研究是必不可少的。

具体来讲，在化学制药工艺研究中需重点考察的外部条件主要有以下七方面。

（1）配料比与反应物浓度　参与反应的各物料之间的物质的量的比例称为配料比（也称投料比），又称为投料的摩尔比。对不同的反应类型应采取不同的配料比，一方面使原料尤其是价格较高的原料尽量转化为产品，另一方面要尽量抑制副反应的发生。反应物的浓度除决定溶剂的用量外，某些情况下也会决定反应的选择。

（2）溶剂　药物合成反应一般在溶剂中进行，溶剂一方面溶解反应物质，另一方面也是进行化学反应的介质，溶剂极性的大小对反应速率、选择性、产品的构型等都可能产生影响。另外，重结晶是化学制药工业中一种常用的分离纯化方法，重结晶溶剂的选取也非常关键。

（3）催化剂　催化剂是化学工业的支柱，也是化学研究的前沿领域。现代化学工业生产中80%以上的反应都涉及催化过程。化学制药生产过程中也常应用催化反应，如酸碱催化、金属催化、相转移催化、酶催化等，在加速化学反应、提高反应的选择性、提高产品的纯度和收率方面发挥了重要作用。

（4）温度和压力　反应温度不仅影响反应速率，还能影响反应的选择性和平衡反应的方向，因而反应温度的选择是每一个反应都必须考虑的因素。

反应压力的变化主要影响有气体参与或产生的反应。

（5）反应时间及反应终点的监控　化学制药的反应过程是在一定条件下将反应物料通过化学反应转变成产品的渐进过程，无谓地延长反应时间只会降低生产效率，还可能增加副反应。因而，如何准确地判定反应已进行完全是控制反应时间的关键。在反应过程中必须采用各种手段，如薄层色谱、气相色谱、液相色谱等监控反应的进行，进而确定最佳的终止反应的时间。

（6）后处理　药物合成反应常伴有副反应，包括平行副反应和连串副反应等。反应结束后的物料体系中除包含目标产物外，往往还含有未反应的原料及生成的各种副产物。为确保产品的收率和质量，必须使原料尽量转化，同时通过控制其他反应条件使生成的副产物尽量少。但无论如何，最终产品的分离纯化都是必不可少的，而且分离方法的确定和优化必须建立在对反应物体系组成充分认识的基础上。化学制药工业中常用的分离技术分为机械分离和传质分离两大类，前者包括过滤、重力沉降、离心沉降等，后者包括精馏、萃取、结晶、吸附、离子交换等。

（7）产品的纯化和检验　药品是一种特殊的商品，为了保证化学原料药的质量符合国家规定的药品标准，所有的生产过程都必须符合《药品生产质量管理规范》（GMP）的要求，如中间体都必须制定明确的质量控制标准，化学原料药的最后工序（精制、干燥和包装）必须在专门的“精烘包”车间进行。

小试研究的主要对象就是以上的七个方面，当然对不同的反应步骤进行工艺优化时也应根据反应及体系的特点而有所侧重。

2.3.2.2　小试的研究方法

影响药物合成反应的外部因素很多，而且相互影响相互制约，所以在深入研究这些外部因素时，往往需要采用系统科学的试验方法，常用的包括单因素平行试验优选法、多因素正交设计优选法、均匀设计优选法和单纯形优化法等。

（1）单因素平行试验优选法　是在其他条件不变的情况下，考察某一因素对产品收率、纯度等的影响，最终通过设立不同的考察因素来优化反应条件，其研究过程大致如下。

①确定评价反应结果优劣的方法和影响指标的主要因素。即建立以x为影响因素的指标函数F（x）；

②计算包含最优点的试验范围，即x的取值范围为a≤x≤b；

③进行试验；

④试验结果分析；

⑤进行下一轮试验，再分析结果，如此循环，直至得到满意的结果；

⑥如果发现3～5个试验点对指标的改变并不大，可以认为在试验范围内该因素不是主要影响因素，不必继续对该因素进行研究。

（2）多因素正交设计优选法　正交设计（Orthogonal Design）的理论研究开始于欧美，20世纪50年代已经进行推广应用。它是在全面试验点中挑选出最有代表性的点进行试验，挑选的点在其范围内具有“均匀分散”和“整齐可比”的特点。“均匀分散”是指试验点均衡分布在试验范围内，每个试验点有充分的代表性。“整齐可比”是指试验结果分析方便，易于分析各个因素对目标函数的影响。由于正交设计法是基于数理统计原理来科学合理地安排试验，并按一定规律分析处理试验结果，从而能够较快地找到工艺的最佳条件，且具有可判断诸多因素中哪种是主要影响因素，以及判断影响因素之间的相互影响关系等优点。

正交表可用L_n（t^q）表示。L表示正交设计；t表示水平数；q表示因子数；n表示试验次数。如L₉（3⁴）正交表的正表（不包括表头）有四列九行，下标9表示做九次实验。括号内3表示三水平数，上标4表示四列，L₉（3⁴）正交表最多只能安排四因子试验。各种正交表格的设计方法可参考相关书籍。

正交试验设计一般有以下五步：

①找出正交表的因子，确定试验水平数；

②选取合适的正交表；

③制定试验方案；

④进行试验并记录结果；

⑤试验结果的计算分析。

（3）均匀设计优选法　均匀设计（Uniform Design）是由我国数学家方开泰将数论应用于试验设计而创造出的一种适应用于多因素、多水平试验的试验设计方法。均匀设计与正交设计的不同之处在于不考虑数据整齐可比性，而是试验点在试验范围内充分均衡分散，这样就可以从全面试验中挑选出更少的试验点为代表进行试验，得到的结果仍能反映该分析体系的主要特征。这种从均匀性出发的设计方法，称为均匀设计试验法。用均匀设计可适当增加试验水平而不必担心导致如正交设计那样试验次数呈平方次增长的现象。

均匀试验设计的突出优点是试验的工作量很少，特别适用于水平较多时的试验安排。与正交表不同，为了保证不同因素、水平所设计的试验均匀分布，每个均匀表都带有一个使用表，指出不同因素应选哪几列。这是由于均匀表中不同的组合其试验点分布情况不同。通常，为了减少误差和数据处理方便，水平数应大于因素数的2倍，按这个水平选取均匀表，并按表中的使用表选列设计试验。数据一般采用回归分析法处理。

为了达到试验点均匀分布的目的，均匀设计与正交设计一样，也需要按照规格化的表格（均匀设计表）设计试验。不同的是，均匀设计有设计表，设计试验时必须将设计表与使用表联合应用。均匀设计表用U_n （t^q）表示。U表示均匀设计；t表示因素的水平数；q表示最多可以安排的因素数（列数）；n表示试验次数（行数），这里n=t，q=t-1，即试验次数与所取得水平数相等，最多可以安排的因素数比水平数少1。均匀设计的数据一般采用回归分析法进行处理，具体的均匀设计表格及分析方法请参考相关书籍。

（4）单纯形优化法　单纯形优化法简称单纯（Simplex）法，是Spendley于1962年提出的适应于多因素的优化方法。其计算方便，不受因素的限制，在因素增多、试验次数并不增加很多的情况下就能找到最佳条件。本法根据情况将试验点逐步调整到最优化条件，也被称为动态挑优法。

单纯形是指多维空间的一种凸图形，它的顶点数比空间数多1。二维空间的单纯形是三角形，三维空间的单纯形为四面体，n维空间的单纯形为n+1面体。如果多面体各棱长等长，则称为正规单纯形。

单纯形法的基本原理是在一个单纯形的各顶点的条件下安排试验，比较其试验结果，找到最坏的试验点，弃掉最坏点，并取其反射点构成新的单纯形，再按新试验点（反射点）条件进行试验，再经比较试验结果，找出最坏试验结果的试验点，弃掉最坏点，如此往复达到最优化条件。