2.新冠肺炎核酸检测的问题和对策

施毅（2月11日）

目前病毒核酸检测方法存在的困惑包括：①前段时间王辰院士在中央电视台采访时提出，确诊患者中咽拭子的阳性率仅为30%~50%。实际的阳性率有多高，还需要我们进一步探索。②临床已发现CT为肺炎，又有明确流行病学史，但核酸检测阴性者。这是假阴性吗？③由于检测机构少，检测速度远远跟不上临床需要，很多患者因为等待检测而延误诊断和治疗。④根据临床表现判断不是新冠肺炎，但核酸检测却是阳性。会是假阳性吗？因此，核酸检测虽然很重要，能够推动病例确诊，合理使用有限的医疗资源，及时救治患者，但是这些问题也会干扰临床诊断，带来一定的困扰。

目前病毒核酸检测方法的问题包括：①为什么检测的阳性率这么低？是我们的检测试剂不行吗？②临床非常符合诊断标准的病例，为什么检测不出来？③既然检测机构少，为什么不能多开放一些医院进行核酸检测？④为什么会出现假阳性？⑤既然检测不可靠，为什么不能用胸部CT来替代核酸检测？这是临床提出的比较典型的问题。我总体感觉，对于核酸检测存在的问题，我们应该仔细分析原因，改善检测结果。总体而言，最大的问题就是假阴性。对于假阳性来说，最多错隔离了患者，但不会让疾病传播；如果是假阴性的话，就会把可能确诊的患者放出去，造成更大的传播，这个问题更严重。初步归纳假阴性的原因可能与疾病本身特点有关，与咽拭子采样的局限性有关，与运输、保存等问题有关，与PCR试剂盒的缺陷有关。

目前病毒核酸检测问题发生的原因分析下来有以下几点：

（1）标本采集的时机与部位不对导致的误差。病毒感染在不同阶段所影响的器官的深度是不一样的。病毒早期分布在上呼吸道，随着病情发展，上呼吸道病毒被清除，而下呼吸道病毒载量反而升高，因此应该尽量同时采集下呼吸道标本（深部痰液，支气管肺泡灌洗液）。支气管肺泡灌洗液最好，但难以获得，传播风险高，比较耗时，所以并非所有患者都需要做此检查，也不适合。重症患者深部痰不易咳出，但如何能努力咳出来，哪怕是“口水痰”，也比鼻咽拭子强。因此，虽然鼻咽拭子最常用，但与病程密切相关，目前的最佳采样时机尚不清楚。按甲型流感24~72h到高峰，然后迅速下降，那么新冠病毒有没有可能也是如此，到后期是不是就不容易从鼻咽拭子中检测出了？另外，采样的问题与人为因素也有关系，一线采样人员有巨大的感染压力，可能导致采样不彻底、不完全而导致假阴性。此外，采样的手势和拭子的材质质量对样本质量也是至关重要的。

（2）标本运输限制。采样后样本的保存和运输会影响结果。RNA病毒和DNA病毒不同，DNA病毒不太容易变异，但是RNA病毒就特别容易变异，也容易降解。在采集过程中，RNA病毒的核酸由于自降解和生物酶介导的降解，是最难以稳定保存的生物分子之一。因此，含有RNA病毒的样本建议存放于专用的病毒保存液中，且必须在冷藏（即4℃或更低温度）状态下保存并尽快运输送检。新冠病毒的储存和运输要求可能更高。而现状是，大多数医院采集后需要集中送至CDC统一检测，从采样到实际开展检测可能经过长时间的等待，从而影响检测结果。同时开展检测的实验室是否具备专业能力也是影响因素之一。

（3）试剂盒问题。出现核酸检测的标准后，很多公司都开发了PCR试剂盒。国家FDA在全国53家能够生产试剂盒的公司中初步筛选出7家公司，通过应急审批流程，于1月26日首次认定4家公司生产的试剂盒可以作为正式检测试剂盒在临床应用，分别为华大基因新冠病毒检测试剂盒、华大智造DNBSEQ-T7测序系统、上海捷诺新冠病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RT-PCR法）和上海之江新冠病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RT-PCR法），后又增加3家。但是全国有50多家生产试剂盒的公司，一家公司只能供应一部分医院，很多医院用的其实是那些没有批准的试剂盒。所以大量试剂应急上市，不可避免地因产品质量问题和过度宣传等原因引发了一些负面评价。甚至出现了据称能十几分钟检测出结果，敏感度和特异度达到100%的过度宣传。此外，应急审批，最终还是需要按照法规要求补充完成所有的临床验证才能延续注册，从而用于常规临床诊断。

（4）大样本研究及临床验证的缺失。这种试剂盒真的能完全准确地进行检测吗？这本身需要在临床应用中去检测试剂盒的可靠性。大多数新冠病毒检测试剂都是靶向新冠病毒的特定区域，通过RT-PCR扩增病毒的ORF1ab基因和N基因等进行荧光定量检测。然而，新冠病毒属于RNA病毒，很不稳定，容易产生变异，现在针对该病毒的研究刚刚开始，病毒基因的变异频度如何，是否存在突变热点或进化上的保守区域都尚未可知。现在的试剂只能根据有限的公开数据进行引物设计，但对大样本中的实际情况缺乏了解，鉴于临床紧急需要先行使用。很难排除个别样本由于扩增区突变导致假阴性的可能。

（5）试剂缺乏监控核酸提取质量的内标以及样本间、样本内重复。目前的检测试剂盒大多数仅针对核酸提取后的检测，而对于RNA提取的方法以及质量未做明确说明，从而导致不同方法学提取的RNA质量良莠不齐，从而影响最终的扩增效果。同时，缺乏样本间、样本内的重复，也可能造成假阴性。

今后针对核酸检测的应对策略与发展方向如下：

（1）规范标本采集方法。尽可能采集下呼吸道标本，特别是BALF标本或深部痰，这样阳性率更高。掌握采集标本的时机，早期以鼻咽拭子为主，晚期以BALF为主。这并不代表鼻咽拭子后期检测不到，我们有两个病例，确诊后住院将近20天，在这期间间断地进行核酸检测，一直到第20天仍是阳性。规范鼻咽拭子、咽拭子的操作程序；同时做好采集人员的防护（医用N95口罩、护目镜、手套、防护面罩、防护服等）。采用合格的（高质量的材质）采集鼻咽拭子和咽拭子，规范实验室检测的操作流程，保证实验结果的可靠性和正确的解读结果。标本及时送检。比较好的拭子相当贵，不像我们平常拿一个长棉签就可以采集。可以经咽部采集，也可以经鼻腔采集，如图3-2所示。如果要经鼻咽部采集，拭子一定要能够伸到鼻咽部，大部分采集的时候都只在鼻孔这片区域采集，这样阳性率一定不高。所以鼻咽拭子的采集方法非常重要，一定要予以关注。

（2）改进标本的运送。及时采集标本，及时送检标本。降低RNA病毒核酸的降解，样本存放于专用的病毒保存液中，在冷藏（即4℃或更低温度）状态下保存并尽快运输送检。加快检测速度，减少标本等待检测的时间。在具备专业能力的实验室进行检测。

（3）改进试剂盒生产的审批。加快对可靠试剂生产厂家的审批，国家卫健委已经通过应急审批流程首次认定了7家公司生产的试剂盒可作为正式检测试剂盒在临床应用。同时要加快定点医院2P加强实验室的建设，让更多的医院能够及时进行检测。关注检测实验室的生物安全性问题。保证检测试剂的质量，需要所有生产厂家按照法规要求补充完成所有的临床验证才能延续注册，从而用于常规临床诊断。

不同厂家试剂盒性能存在差别，分析原因如下：①引物探针系统的特异性与效率：需要良好的参考序列和生物信息分析能力，选择合适的靶标区域；②工艺体系的稳定性：需要丰富的体外诊断试剂开发能力，建立稳定高效的生产工艺体系。

我们希望去选择具有更高的灵敏度、更可靠的试剂盒来提高检出率和可靠性。应选择通过临床真实阳性样本验证，性能稳定，取得NMPA注册证的试剂，这样产品质量才能有保证。

（4）改善检测技术。采用标准的病毒特定检测区域。2019-nCoV为线性单链RNA（ssRNA）病毒，基因组全长约29903个核苷酸，共包含10个基因。经过对新冠病毒全基因组序列分析，卫健委推荐病毒的3个基因区域（ORF1ab、E、N）可以作为PCR检测的靶序列进行引物探针设计。冠状病毒是一大类病毒，包括SARS、MERS及其他引起普通感冒的冠状病毒。E基因和N基因在冠状病毒内相对保守，尤其与229E/OC43/HKU-1等感染人但传播能力较差的冠状病毒存在交叉，以上病毒在自然循环中本身存在，因此用于做靶序列检测时会导致其他冠状病毒阳性。要避免靶序列带来的交叉污染，需要良好的参考序列和强大的生物信息分析能力找到新冠病毒的特异区域设计适合的引物探针。研究显示新冠病毒的特异区域主要集中在ORF1ab基因和S基因。对于病原检测，并不是越多基因越好。实际上，引物探针之间会互相干扰，导致灵敏度降低，其中二重会弱于单重，三重会低于二重！比如HIV检测试剂盒，靶序列有gag、env基因等，只对其中一个靶序列进行检测，已达到了极高的灵敏度和准确性。

（5）综合评估（回归临床）。最后还是要强调，拿到核酸检测结果后一定要回归临床。加快生产试剂盒，拿到质量好的试剂盒，加强实验室建设，同时规范临床特别是基层医院和卫生服务中心应能正确地采集临床标本，规范实验室检测的操作流程，保证实验结果的可靠性和正确的解读结果。再和临床表现、流行病学史相结合以后进行综合评估，不要单独以阳性、阴性来做决定。

总之，正确的检测方法需要从源头抓起，首先是控制取样的质量，其次是严格的适温保存和快捷的运输，采用可靠的检测试剂盒，规范检测的操作流程，然后再将检测结果和临床表现相结合，最终才能对结果做出合理的判断和解读。

陈荣昌（2月29日）

我个人认为PCR技术会存在假阴性、假阳性，所以每个医院都要开展自己的研究，一家医院的研究结果不一定适合另一家医院，因为使用仪器不同、环境不同、操作人员不同、采样方法正确性不同，所以每个医院都应有针对自己医院的情况来论证自己医院这个方法的特异性和敏感性，如此才能够指导临床诊治。我举一个比较成熟的例子，关于PCR作为结核的诊断方法，10多年前我曾审阅了一篇某个结核病医院的稿件，痰菌阳性组，PCR的阳性率为60%，阴性对照组阳性率为40%。这样的检测结果，显然几乎无法用于诊断，因为特异性、敏感性都不够。但是随着方法的改良（广州呼吸健康研究院的PCR实验室是接受国家的“飞行质检”的），我们这么多年没有出现过对“飞行质检”标本的错误报告。所以，在这里做出来PCR为阳性，诊断的正确率超过90%；如果反复做PCR、取深部痰液或组织进行PCR检查都是阴性，基本上都能排除。但是，一个方法除了方法本身以外，整个团队在实施过程中有没有做好质控等很多细节的问题也很重要。总体而言，不能够以一次结果来决定。比如有些患者在出院前检测PCR阴性，但随访过程中又从阴性转为阳性了，需要综合临床评估，症状是否有反复，有没有新发的病灶，是真的阳性还是假阳性，是否有传染性，这都是非常重要的问题，需要通过临床研究来回答这些问题。我觉得这是很值得综合CDC、临床和实验室的专家团队来共同面对的问题，需要依靠研究数据，才能给出一个有科学依据的答案。

王辰（3月8日）

病毒核酸检测是我们现在使用最多的方法，但核酸检测似乎总是有些问题。由于病毒是新型的，新冠病毒核酸检测的试剂被批准时都没有来得及进行深入的临床检验评估，因此，现在核酸检测在三个环节上的问题都需要给予重视。①采样过程质控：包括采样使用的拭子和运送培养基等是否合格、采样操作的手法是否合规、采集后保存和运输温度是否符合低温要求等；②核酸试剂盒质量；③实验室操作能力。

上述三个环节都是我们需要注意的。现在核酸检测结果或阳或阴，似乎还难以用非常成熟的方法来确定。从早期的实践中，大家看到，对于确诊的患者，鼻咽拭子的核酸检测只有30%~50%为阳性率，正常情况下，核酸检测的阳性率应该比这个数据高很多。尤其是应用RT-PCR的检测方法，从其原理上看，应当是对于连单个细胞内的痕量核酸分子都可以检测到，证明它的敏感性应当是足够的。但如果检测结果是阴性，其实大家首先要考虑的是“试剂有没有问题”，包括现在热议的所谓“复阳”的问题，与其问这类患者到底是不是“复阳”，不如问他们当初是不是“真阴”？这是要大家考虑的，也就是说，或许当初核酸就没有被清除过，只不过我们没检测出来，因为那时病毒的载量低，不如病毒载量高的时候容易检测。因此，所谓的“核酸检测再复阳”从理论上是不符合现有的科学认知的，我们首先要检讨的是“当初到底是真阴还是假阴”的问题。

再次强调，核酸检测要关注三方面的问题：采样的问题、试剂的问题、实验室操作的问题。大家要特别注意用于核酸检测的呼吸道样本的采集问题，实际上现在临床所用的多数是咽拭子，也有用鼻咽拭子或口咽拭子进行采样。有好几家单位对我讲，使用鼻咽拭子检测病毒核酸似乎更可靠一些。这个经验供大家参考。这方面目前还需要科学的数据和严谨的评估来帮助形成标准操作程序。

但我想和大家说，鼻咽拭子只是核酸采样的可选部位之一，现在可以从5个部位进行核酸采样。第1个部位是咽拭子，很多单位提示最好经鼻取咽拭子。第2个部位是晨起没有刷牙、漱口时舌下的唾液，那里是病毒容易聚集的位置。第3个部位是深部的呼吸道分泌物，包括两种，一种是痰，或咳出来的，或经气管插管吸出来的，另一种就是BALF——支气管肺泡灌洗液。第4类是血，很多地方不查血中的病毒核酸，其实这不对。血液中除了病毒血症阶段病毒载量相对较高，其他时候病毒含量较低，对于血液还是应进行采样和核酸检测的，特别需要评价核酸载量。第5个部位是肛拭子，取材应该深一些，取直肠黏膜的拭子。有些单位的经验是，当咽拭子检测已经呈现病毒阴性之后，肛拭子还可能是阳性的，这个道理我们需要再慢慢地观察思考，再去发现它的规律。面对这个新发的疾病，很多方面我们都要以探查、探究的态度去看待，不要以太个性化的局部经验代表全部，因为个性化的经验容易是“盲人摸象”式的经验。仅仅一个核酸检测，就要考虑从采样到检测的过程，采样要考虑到采集部位、病毒在体内分布和感染情况，等等。所以，这就是病原体检测方面我们需要再提高的地方。

现在临床上有很多“怎么看怎么像”的患者，而检测后却发现核酸是阴性的，我们就要检讨一下从试剂盒到采样的诸多问题，这样能够有更稳健的基础来评价核酸检测结果到底是阴还是阳，是真阴真阳，还是假阴假阳。此外，呼吸道感染病原体种类繁多，感染症状体征相近，在进行新冠病毒检测的同时，不能忽视对其他呼吸道感染病原体的监测。