第四节 高通量筛选和高内涵筛选
高通量筛选技术（high throughput screening，HTS）和高内涵筛选技术（high content screening，HCS）均是以药物发现的基本规律为基础、应用多学科的理论知识、集多种先进技术于一体形成的快速、高效、大规模的药物筛选体系。
一、高通量筛选技术
（一）高通量筛选及特点
高通量筛选技术产生于20世纪80年代后期，它将多种技术方法有机结合，以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在同一时间内对数以万计的样品进行生物活性检测，并以相应的信息管理软件支持整个技术体系的正常运转。
高通量药物筛选技术可以实现每日数万样品的筛选，特别是在最近几年中，筛选速度和内涵得到了显著的提高和发展，形成了超高通量筛选技术（Ultra- HTS）。超高通量筛选技术包括两方面内容：第一，检测速度进一步提高，筛选规模达到每日数十万样品；第二，与生物芯片技术结合，将数以万计的基因或生物分子集成应用，使高通量筛选的单靶点、单模型模式转变为同时对多靶点进行筛选的新模式。
因此，高通量筛选技术具有以下基本特点：①符合药物发现的基本规律：高通量筛选依赖大容量样品库，实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药用物质资源，提高了药物发现的概率。②充分利用药用资源：高通量筛选采用的是分子和细胞水平的筛选模型，筛选实验是在微量系统中完成，检测体系一般在2～250μl，样品用量一般在微克级（μg），节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础。③高度自动化操作：高通量筛选具有自动化操作系统，即实验室自动化工作站，能够自动、连续的完成加样、稀释、转移、混合、洗板、温孵、检测等整套实验操作；具备灵敏快速的检测仪器，可对不同规格微板中的样品直接进行测定，如化学发光测定、可见光比色、荧光测定、核素放射活性测定、电化学测定等。④多学科理论和技术相结合：在高通量筛选的过程中，不仅应用了普通的药理学技术和理论，而且与药物化学、分子生物学、细胞生物学、数学、计算机科学等多学科紧密结合。这种多学科的有机结合，在药物筛选领域产生了大量新的课题和发展机会，促进了药物筛选理论和技术的发展。
（二）高通量筛选的基本过程
高通量筛选以药物作用靶点为主要研究对象，根据样品和靶点结合的表现，判断化合物生物活性。高通量药物筛选一般要经过以下几个步骤：
1.初筛和复筛
药物的初筛（primary screening）和复筛均是在分子、细胞水平筛选样品，检测某一样品对某一靶点是否具有药理活性（或亲和力）。初筛时，主要观察样品在一种浓度表现出的基本活性。在初筛中发现的具有一定活性的样品，可以进入复筛程序。复筛时，将样品稀释成系列浓度，采用同一模型，阐明样品对靶点的作用特点、作用强度和量效关系，由此确定为活性化合物（active compound）。
2.深入筛选
深入筛选（secondary screening）是在初筛和复筛的基础上，采用与初筛不同但密切相关的分子和细胞模型，对活性化合物进行深入的药理作用评价，阐明活性化合物的选择性、细胞毒性以及其他性质。根据获得的实验资料，结合活性化合物化学结构的性质特点，进行综合分析，确定化合物的药用价值，选择结构新颖、作用确切的化合物作为先导化合物（leading compound）。
获得先导化合物后，可以直接作为药物候选化合物进行开发，也可借助化学方法或计算机分子设计技术进行结构修饰和优化，以便得到活性更高、缺点更少的先导化合物。
3.确证筛选
确证筛选（confirmatory screening）是对先导化合物进行更为深入的研究，包括药理作用、代谢过程、一般毒性等多方面的内容，以确定其开发前景。对符合药物要求的样品，确定为药物候选化合物（candidate compound），进入开发研究程序，即临床前研究，为临床研究准备必要的资料。
（三）高通量筛选模型的常用技术方法 1.高通量药物筛选模型的一般要求
药物筛选模型（drug screening model）是用于证明某种物质具有药理活性的实验方法模型。由于药物作用过程是在微量条件下进行的，因此模型的设计应符合以下基本要求：
（1）特异性：
高通量筛选模型的特异性包括药物作用的特异性和疾病相关的特异性。筛选结果可以说明药物的作用原理，证明药物与靶点是否发生了特异性的相互作用。疾病相关的特异性是指该模型能够反映某种疾病的病理过程。
（2）灵敏性：
筛选模型的灵敏性包括两方面的含义：一是能够灵敏地反映样品在该模型上的作用；二是阳性对照与空白对照之间的范围或信噪比能够足以反映样品作用的层次。
（3）稳定性：
筛选模型在运行中要具有可靠的稳定性，根据模型研究过程建立的标准操作程序，能够在重复实验中获得一致的结果。由于高通量药物筛选的规模巨大，实验方法的稳定性要比其他实验方法要求更为严格。
（4）可操作性：
是指建立的筛选模型在微量、体外可控条件下稳定地反映筛选结果，可进行大规模实验。筛选模型的操作步骤越少、操作过程越简单，实现高通量自动化筛选就越容易。因此，在建立高通量筛选模型时，应尽可能地减少操作步骤，简化操作程序。
2.常用高通量药物筛选模型 （1）分子水平药物筛选模型：
分子水平筛选模型是高通量药物筛选中使用最多的模型，其最大特点是药物作用靶点明确，应用这种方法筛选可以直接得到药物作用机制的信息。根据生物分子的类型，主要分为酶、受体和其他类型的模型。
1）以酶作为药物靶点：
在疾病进程中参与病理性代谢、信号转导、蛋白加工或免疫反应等过程的酶都可以成为药物靶点。与整体动物和组织、器官水平的筛选模型相比，酶分子水平的筛选模型的最大特点是药物作用靶点明确，可直接得到化合物与靶点酶分子的作用信息。
检测酶活性的方法很多，酶的反应底物、产物等都可用作检测指标，反应大多在均相的环境下进行。检测方法主要有比色法、荧光法、发光法、放射性核素法等。这些常用方法将在后文进行介绍。
2）以受体作为药物靶点：
受体与许多重要疾病的发生发展密切相关，占所有药物靶点的60%以上。受体在新药研究中的作用主要体现在三个方面：第一，用于新药筛选靶点；第二，基于受体的药物合理设计；第三，降低药物的毒副作用。
筛选作用于受体的药物，通常使用放射标记竞争结合分析法。这一方法具有灵敏度高、特异性强等特点，适合于大规模筛选。近年来也有一些新的方法出现，如荧光偏振、反酵母双杂交技术等，检测的指标都是样品与受体分子的结合情况。
（2）细胞水平药物筛选模型：
细胞水平的筛选模型（cell based assay method）是观察被筛选样品对细胞的作用，能够反映出药物对细胞生长过程、作用途径的综合作用。用于筛选的细胞模型包括动物细胞、植物细胞、微生物细胞或经过基因工程技术转基因的特殊细胞。
与分子水平筛选模型相比，细胞水平筛选模型的优点是：①细胞模型为靶点分子提供一个类似于机体的环境和生理条件；②细胞水平的筛选可以检测化合物分子是否能够进入细胞并达到靶点分子所在部位；③阳性化合物出现概率较低；④可筛选得到前体药物；⑤通过细胞水平筛选得到的活性物质，在动物水平有效的可能性相对较高。
与分子水平筛选模型相比，细胞水平筛选模型的缺点是：①有时灵敏度相对稍差；②操作相对复杂；③筛选成本相对较高。药物对细胞的作用可以有多种表现，如基因转录、离子通道开关、细胞毒性、细胞分泌、蛋白表达、酶活性变化等。
基于细胞的高通量筛选模型主要有以下几类：①观察化合物样品的细胞毒性：这类模型检测指标是细胞的生殖状态，如应用肿瘤细胞模型筛选抗肿瘤药物；②构建特定启动子操纵的报告基因系统：该系统可将待研究的目的基因与报告基因编码区相连，报告基因的编码产物主要是酶或蛋白，如荧光素酶、分泌性生长激素、分泌性磷酸转移酶、荧光蛋白等，这些酶或蛋白提供了一种高度放大的信号，保证了系统的灵敏性和稳定性；③作用于G蛋白偶联受体（GPCR）的药物筛选：GPCR- FLIPR tm- Ca 2 +反应体系可用于判断化合物对受体的作用，在本系统中，一般直接测量受体介导的cAMP聚集作用，或测量细胞内Ca 2 +浓度变化；④转运蛋白-放射性标记配基摄取系统：这类模型用于筛选氨基酸和神经递质的载体靶蛋白，观察细胞转运蛋白和配基的结合情况，检测时间短；⑤以离子通道为靶点的药物筛选：膜片钳是分析离子通道的“金标准”，膜片钳阵列技术可通过在微孔板设置电极记录全细胞、单通道以及人工构建双分子层的电流，实现大规模、自动化、平行性的样品筛选。
（3）其他类型筛选模型：
应用生物芯片进行药物筛选，能够在微小的芯片上获得大量的生物活性数据。目前，多种与疾病相关的动物模型已经用于药物筛选，如阿尔茨海默病小鼠模型、亨廷顿病小鼠模型。此类技术尚处于发展阶段，存在许多需要解决的技术问题。
3.高通量药物筛选常用检测方法
高通量药物筛选中使用的检测方法很多，常用的方法主要有比色检测法、荧光检测法、放射活性计数法、发光计数法、形态学方法、核磁共振检测法等。
（1）比色检测法：
该方法是最经典的酶检测方法，主要通过检测反应的底物或产物在紫外或可见光下最大吸收值的变化，间接地反应体系中酶的活性。优点是操作简便，对仪器要求简单，普通酶标仪即可满足一般高通量筛选的要求。缺点是灵敏度相对较低，需要较大的酶量和底物浓度。
（2）荧光检测法：
荧光检测法具有灵敏度高、使用方便的特点，灵敏度比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级，其检测下限可达到0. 1μg/cm 2。荧光检测法的技术关键在于荧光物质的标记和荧光物质（指示剂）的获得。目前常用的荧光检测法主要包括荧光强度法（fluorescence intensity，FI）、荧光偏振（fluorescence polarization，FP）、均相时间分辨荧光（homogeneous time- resolved fluorescence，HTRF）、荧光共振能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）、荧光时间寿命（fluorescence lifetime，FLT）等。
1）荧光强度法：
该方法一般需要底物或产物有荧光特性，利用物质激发波长和发射波长的变化，进行物质的选择性测量。
2）荧光偏振检测法：
该方法是根据荧光发射的方向性原理设计的分析方法，在检测酶催化反应、研究蛋白质相互作用等方面使用较为广泛。在酶抑制剂筛选方面，测定原理是以荧光素标记的底物作为抗原，经过酶反应后加入相应的抗体，底物和抗体结合形成的大分子物质旋转慢，发出的偏振光强，没有和抗体结合的小分子物质旋转快，偏振光弱，由此可以通过荧光偏振的强弱反映酶在体系中的浓度。该方法优点是所需样品量少、灵敏度高、重复性好、操作简便。
3）均相时间分辨荧光：
均相时间分辨荧光分析法是一种多参数荧光测定技术，利用激发波长和发射波长的变化，进行各种物质的选择性测量。该方法选用的示踪剂不是普通的荧光素，而是镧系元素铕（Eu）、铽（Tb）、钐（Sm）等，它们在紫外光激发下，能够发射微弱的离子荧光。将这些能够发出微弱荧光的元素以紫外光吸收配体螯合起来，并使之微囊化（microcapsulation），这时再给予紫外光照射，即可产生很强的荧光信号。一般自然本底荧光衰减时间为1～10纳秒，而Eu 3 +、Tb 3 +、Sm 3 +的衰减时间分别为1020微秒、148微秒和50微秒。待本底荧光衰减后，所测荧光即为纯Eu 3 +、Tb 3 +、Sm 3 +离子荧光，减少了本底干扰，提高分析灵敏度。
该法具有专一性好、灵敏度高、无放射性危害、标记物稳定、线性范围宽、分析速度快和操作简便等优点。
4）荧光共振能量传递：
该方法是指在合适的能量供体和受体分子之间非放射性的能量转移。荧光共振能量转移由两部分组成：镧系元素螯合物作为能量供给者，有机探针作为能量的接收者。该方法主要进行受体-配基结合分析，如抗原-抗体反应、受体-配体结合或蛋白-蛋白相互作用分析。
荧光共振能量转移分析法采用两种荧光物质标记，一是以接受能量后可以产生长时间衰减荧光的螯合物作为标记物质，二是以短时间衰减的共振荧光物质标记，前者在检测中作为能量供体，而后者作为前者能量的受体，后者产生的荧光是检测的信号。当标记物由于结合反应而被带到非常接近的位置，并且能量供体和受体之间波长符合共振条件时，两者之间发生能量转移。能量转移分析法的最终检测是记录接收者的时间分辨荧光强度。由于这种反应需要存在共振条件，因此受到的干扰因素就相对减少，提高了分析法的特异性。
（3）发光检测法：
有些生物物质和化学物质在一定条件下进行化学反应时，可以产生发光现象，分别称为生物发光或化学发光；有些化学反应发生电荷的产生和转移，又称为电化学发光。利用这些发光反应所产生的光线的强弱，可以判断反应进行的程度。
该方法的特点是灵敏度高、特异性强、操作简便。目前用于检测巨噬细胞激活反应、腺苷类物质浓度测定以及微生物产生反应等。
（4）放射性核素检测法：
放射性核素检测法是检测受体配体结合程度以及酶活性变化的常用方法之一。一般是用放射性核素标记底物，测定放射性产物的生成情况。该方法最大的优点是灵敏度高、干扰少、假阳性少。缺点是可产生环境污染，成本相对较高。
近年来，放射性核素检测法取得了很大的进展，出现了很多新技术。最具代表性的技术是20世纪90年代早期发展的亲和闪烁分析法（scintillation proximity assay，SPA）和FLASHPLATES TM技术。
SPA无须分离步骤，可连续观测，适用于自动化操作和高通量筛选。该技术的原理是把药靶分子（如受体、酶）固定于微球，与放射性核素标记的配体（闪烁液）孵育一段时间，使标记的配体与固定在微球上的药靶分子结合。当受体和配基结合以后，核素标记的配基与亲和闪烁的微球表面距离缩小，放射性核素靠近固相支持物，标记配基产生的放射活性（通常为β粒子）与闪烁物之间通过能量传递导致微球光闪烁。而在缓冲液中的放射性核素由于距闪烁液较远，产生的放射β粒子能量发散到环境中，而不能引起闪烁液的发光。这样，通过对发射的光子计数进行检测，只有结合到固定药靶分子表面的标记配体被检测到，而未被结合的标记配体则不被检测，根据测定结果即可判断药靶分子与配基结合的程度。
该技术的优点是省去了分离步骤，只要加入标记配基，经过孵育，然后就可以直接进行测定。SPA方法的不足之处是需要通过一定的方法把受体固定在微球上。目前，已经开发出多种闪烁微球可供选用，如检测RNA转录、药物与α-肾上腺素受体亚型亲和力定量分析、P56激酶活性、肝炎C病毒NS3蛋白酶抑制剂的药物筛选等。
FLASHPLATES TM技术与SPA技术相似，但固体表面是微板而不是微球。采用这种方法，直接将受体固定在具有闪烁液的微板表面，可有效地降低干扰，效果比微球法更为优越。FLASH- PLATES TM在药物筛选中已经开始应用，如测定cAMP水平、分析配体-受体结合反应等。
（5）形态学方法：
细胞水平的高通量药物筛选方法可以反映出药物对整体细胞的作用，筛选结果能够提供更多的关于样品的生物活性信息。以细胞为观察对象，除一般常用的检测指标外，细胞形态学的变化具有重要的意义。
近年来，为了适应高通量药物筛选的需要，已经开发出能够对96孔、384孔微板成像的设备，可以同时对微板每个孔中的细胞形态进行成像分析，提高了形态学分析的效率。
（6）核磁共振检测法：
应用核磁共振技术可进行药物作用机制研究，主要用于研究小分子化合物与生物大分子的相互作用，可以提供比其他生物活性检测方法更多的信息。
电子喷雾离子质谱（electrospray ionization mass spectrometry）和核磁共振光谱（NMR spectrometry）可以用作化合物的筛选，在化合物质谱中可以观察到化合物与一个靶点分子（如受体或酶）紧密结合组成的非共价复合体。改变碰撞能（collision energy），测定复合体解离时的能量，就能测得配体的亲和力。
4.筛选模型的评价
对高通量筛选系统的正确评价可以判断整个药物筛选实验的质量，以及由此所获得的结果的可靠性。为了使模型能够达到筛选要求，需要对筛选模型进行定量评价，评价药物筛选模型常用的定量技术参数有：
（1）信号本底比（signal to background，S/B）：
信号本底比反映的是筛选模型获得的数据与本底数据之间的差距。一般来讲， S/ B越大，信号与本底的距离越大，筛选模型对被测样品的区分度越大。信号本底比可以按照下式计算：
S/B = Msignal/Mbackground
式中， S/ B为信号本底比； M signal为测得的信号数据平均值； M background为测得的本底数据平均值。一般情况下，信号本底比的数值应大于3。
（2）信噪比（signal to noise，S/N）：
信噪比是仪器分析中常用的方法评价参数，噪音通常是指在同样测定条件下，本底所产生的记录信号。下式是经过改良用于高通量药物筛选模型评价的信噪比计算式：
式中， SD为标准差 。
通常情况下，按照该式计算的信噪比要大于10才能认为是可以应用的方法。
（3）信号本底变异系数（coefficient of variation of signal and background， CV）：相对变异值可以反映信号的变异情况（变异性），计算时很少用本底值，因为获得的值接近于0时，就不能反映 CV的实际情况。变异性可以评价方法的稳定性、溶液操作的准确性和仪器测定的精确性。
CV（%）=100× SD/ M
（4）Z'因子（Z'factor）：在评价高通量药物筛选模型的方法中，Z'因子是广泛接受的评价指标。它将评价模型质量的主要参数信号窗和信号变异相结合，达到了良好的评价效果。
Z' =1 -3×（ SD signal+ SD background）/︳ M signal- M background|
Z'因子与 S/ D、 CV有直接而密切的关系，但经过推导，可以得出下式：
Z' =1 -0. 03×（| S/ B |× CV signal+ CV background）/（| S/ B | -1）
Z'因子是没有单位的参数，其值在0～1。当Z'因子为1时，信号与本底无限分离；当Z' =0时，信号与本底开始交叉。一般要求Z'＞0. 4的模型方可用于筛选。
二、高内涵筛选技术
（一）高内涵筛选的概念
1999年，Cellomics公司研制开发并生产了世界第一台高内涵细胞分析仪，该项技术的问世揭开了药物筛选研究崭新的一页。随后，国外其他公司也相继开发出同类产品，展开了高内涵筛选技术的多方面研究。
所谓高内涵筛选（high content screening，HCS），是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。从技术层面而言，高内涵筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、多层次的筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息。
（二）高内涵筛选的优势
与目前广泛使用的HTS技术相比，HCS的优势可以从以下三个方面体现：
1.以细胞为单位，实时、动态观测，适于进行多成分物质的评价和研究
传统的HTS主要是分子水平的筛选，以微孔为单位，获得的信息是微孔板中的平均反应数值。HCS通过实时荧光显微成像和定量图像分析同步反映出样品与单一靶点或多个靶点作用后的细胞生物学功能和结构的变化，从单个或细胞群体的反应中获取定量数据，解析活细胞中复杂的生物语言。相对于HTS分子水平的筛选，HCS不受复合物筛选样品对靶点分子的干扰，能全面反映样品的动态作用与最终综合效应。
2.多靶点检测，实现“一药多筛”
HTS可快速发现活性化合物，但其检测模型均建立在单个药物作用靶点的基础上，无法全面反映样品的生物活性特征。HCS通过同步应用报告基因、荧光标记、酶学反应和细胞可视化等常规检测技术，实行多靶点、多指标平行检测，满足一个组分成分具有多个作用靶点的药理学基础要求，可以获得包括细胞毒性、代谢调节和对其他靶点的非特异性作用等多重效应数据，使研究人员在早期阶段即可获得活性化合物对细胞产生多重效应的详细数据，提高了发现先导化合物的速度，增加了药物后期开发的成功率。
3.准确可靠
首先，HCS获取信息是以细胞为单位，克服了模型细胞数量不一所造成的误差；其次，根据筛选结果，对于效应差异的细胞可以进一步区分，有利于发现活性物质对细胞个体差异影响的复杂机制。
（三）高内涵药物筛选的技术和应用 1.细胞形态观测
在病理状态下，细胞的形态往往发生改变，这些变化有：细胞面积和细胞间距发生改变，细胞器、大分子簇或细胞骨架发生位移，细胞群落的形状、大小和每个细胞相对位置发生变化等。
高内涵筛选技术可以自动定量并统计分析细胞形态的变化，使用者可从3个层面来研究细胞的形态改变。
（1）全细胞形态检测：
包括形状、大小、突起的数量、长短和方向。
（2）亚细胞形态检测：
包括细胞内颗粒、纤维或细胞器的位置、走向、数量。
（3）多细胞或细胞间形态：
多细胞检测包括细胞群落或多核细胞的外形、细胞或细胞核的分布情况等。
2.细胞毒性研究
早期、快速和体外毒性评价是提高药物发现效率和准确度的关键所在。当前已经实现高通量化的细胞毒性检测技术主要分为两类：①基于线粒体活性的方法，如MTT法、ATP生物发光法等；②基于细胞膜通透性的荧光染色法，如碘化丙啶（propidium iodide）等。
高内涵筛选方法实现了通过荧光染色检测细胞凋亡的高通量技术。例如，以3种荧光染料Hoechst、Rhodamine 123、Rhodamine phalloidin分别标记细胞核、线粒体和微管，应用ArrayScan TM高内涵系统对图像进行自动采集和分析，根据细胞密度、细胞核形态、线粒体聚集以及微管形态变化等指标可系统分析样品的毒性及其作用机制。
3.受体功能检测
G蛋白偶联受体是最大的细胞表面受体家族，是药物靶点研究领域的热点。这类受体的功能性实验大多是基于细胞内钙流测定、报告基因表达或受体内化检测。
大多数G蛋白偶联受体被激动后，可以从细胞表面内吞进入细胞内，即发生受体内吞。根据这一现象，在研究的受体C-末端连接绿色荧光蛋白，并通过融合蛋白转染技术构建各种工程细胞株，可动态观察受体的激活过程，同时寻找目标受体的激活剂。
对pH敏感的染料也可监测G蛋白偶联受体的活性。CypHer- 5是一种对酸度敏感的花青素（cyanine）染料衍生物，在酸性环境下可以检测到其产生的荧光。如果在受体的N-末端进行表位附加（epitope lagging），选择标记CypHer- 5的抗体进行染色，则只有在受体激活后发生内吞并进入酸性内体的染料才会被检测到。这种方法对Gs、Gi和Gq等结合的受体都适用，信号干扰少，可与绿色荧光蛋白标记平行使用。
4.信号通路分析
细胞信号转导通路本身和相互之间的交流调控方式极其复杂，传统的实验方法，如Western blot、凝胶迁移滞后检测等，烦琐耗时，不能研究单细胞反应。高内涵筛选技术通过转录因子报告基因构建、细胞水平基因重组、荧光标记等技术，实现了对信号通路高通量化、可视化和实时动态的检测和研究。
例如，NF-κB通路在炎症的发生和发展中起着非常重要的作用，通过克隆和表达得到 NF-κB- p65融合蛋白基因，并将其转入pEGFP- N真核表达载体系统，转染进入U2OS细胞，建立NF-κB稳定转染细胞系。在未受刺激的静息细胞中，NF-κB与IκB结合为无活性的复合物存在于胞质中，当受到TNF-α刺激后，IκB被降解，NF-κB- p65释放后转位进入胞核，从而产生一系列的核内活动。据此采用EGFP指示NF-κB p65的表达与位置的变化，可发现NF-κB的激动剂或抑制剂。
5.动态分析检测
应用高内涵成像技术进行活细胞动态可视化研究主要体现在两个方面：①应用有机小分子染料，测定细胞内离子浓度、线粒体膜电位、细胞器定位和功能等；②采用绿色荧光蛋白、pDsRed及两者变异体的融合蛋白标记技术，可视、定量检测生物大分子的表达、分布、活化和位移。表2- 2中列举部分活细胞研究常用的荧光技术。
表2-2 活细胞动态研究中常用荧光技术
如今，高内涵筛选已在新药发现的多个方面开始应用，但它仍然处于发展阶段，在新药研究领域仍面临许多挑战，例如，在仪器运转速效、图像分析处理等方面有待进一步提高，标记靶点分子的技术更需超越现有的荧光染料。总之，随着操作系统、应用工具和实验技术的不断开发，它将成为基于细胞的靶点优化、先导化合物确立以及药物结构与功能关系研究的重要技术手段。