检测特定基因或序列位点甲基化状态方法，包括甲基化敏感性限制性内切酶聚合酶链反应（methylation-sensitiverestriction enzymes-based quantitative PCR，MSRE-qPCR）/DNA印迹法、甲基化特异性的PCR（（methylation-specific PCR，MS-PCR）、甲基化敏感性单链构象分析（methylation-sensitive，single-strand conformation analysis）、重亚硫酸盐限制酶组合分析（combined bisulphate restriction analysis，COBRA）、甲基化敏感性斑点分析 （methylatinn sensitive dot blot assay，MSDBA）、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳（methylation-specific denaturing electrophoresis，MS-DGGE）、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸法（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）、甲基化荧光检测（methylight）、甲基化特异性多连接依赖性探针扩增（methylation-specific multiplex ligation dependent probe amplification，MS-MLPA）、焦磷酸测序（pyrosequencing）等。在此，我们着重介绍目前应用较广、方便实用的几种方法：

DNA甲基化检测大多首先进行重亚硫酸盐处理，在高温和低pH条件下，将变性DNA（单链DNA）中的胞嘧啶转化为胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物，这个反应是可逆的；接下来胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物发生不可逆的水解脱氨基过程，形成尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物。最后在高pH条件下尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物脱磺酸基形成尿嘧啶。只有未甲基化的胞嘧啶在重亚硫酸盐处理下发生碱基变化，5- ^mC和5- ^hmC仍然保持不变（图4-1）。该处理可以使用专用试剂盒来进行，转化处理后的DNA经PCR扩增，尿嘧啶（U）转变为胸腺嘧啶（T）。

焦磷酸测序技术（pyrosequencing）可以给出启动子一段区域的测序结果和甲基化程度的精确比率，是甲基化精确定量的检测平台，可以说是甲基化检测的“金标准”。样品前期经过亚硫酸盐处理，然后设计引物扩增出片段，将PCR产物上机检测，根据特定位点T/T+C的比值计算出甲基化的水平。

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）和腺三磷双磷酸酶（apyrase）4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3′末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP，在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在apyrase的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息（图4-2）。

该方法可以检测到单碱基分辨率，但是由于技术限制扩增的片段较短（约60bp），所以引物设计是实验成功的关键。

应用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）时，前期样品也是经过亚硫酸盐处理，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物构建文库，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。该方法优点在于扩增片段长（300～500bp），能够得到单碱基的甲基化状况，但是需要挑选大量克隆进行测序，过程较为烦琐、昂贵（彩图4-3）。

甲基化特异PCR法（methylation-specific PCR，MSP）只需要普通的PCR仪即可进行相应的研究。样品前期先经过亚硫酸盐处理，针对处理后的片段设计两对引物，一对扩增发生甲基化的片段板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。该方法前期亚硫酸盐处理和后续的引物设计是关键，引物一般设计在CpG位点上，如果处理不好，很容易出现假阳性和假阴性。

还有一些方法可检测DNA的甲基化，如果检测位点多，样本少时可选用高分辨率溶解曲线（high resolution melt，HRM），它是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG 位点的检测技术，主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性，应用高分辨率的溶解曲线对样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。HRM技术特别适用于样本量多，检测位点较少的甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法（检测位点多，样本少）的高通量方法，同时也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。采用HRM技术进行甲基化检测，引物设计类似于BSP的引物设计。同样是利用引物扩增出包含目标甲基化位点的DNA片段，BSP采用测序的手段检测甲基化水平，而HRM采用溶解曲线分析的手段。

检测位点少而样本多时可选用荧光定量法（methylight），此方法利用TaqMan 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸盐处理DNA片段，针对甲基化和未甲基化各设计一个探针，用不同的荧光标记，随后开展实时定量PCR。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号，根据荧光信号的比值计算甲基化水平。

此外还可以利用联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法，DNA样本经亚硫酸盐处理后，利用PCR扩增，扩增产物纯化后用限制性内切酶（BstUI）消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化（5mCG5mCG），则 PCR扩增后保留为CGCG，BstUI能够识别并进行切割；若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。

Sequenom结合碱基特异性酶切（分子切割）和MALDI-TOF检测原理可实现多重CpG的分析检测，同时具有DNA甲基化定量分析能力。将待测DNA经过亚硫酸盐处理，DNA中未甲基化胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），而甲基化修饰的胞嘧啶不变。通过PCR扩增过程引入T7-启动子序列，经T7 DNA聚合酶的体外转录过程得到各样本RNA产物。经过碱基特异性酶切处理，得到RNA小片段，并用飞行质谱检测每个片段的分子量，最后 EpiTYPER程序完成数据的自动化处理并报告每个检测片段的甲基化程度。

还有甲基化敏感性限制性内切酶- PCR/Southern法 （methylation-sensitive restriction endonuclease -PCR/Southern，MSRE-PCR/Southern），这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ（CCGG）和SmaⅠ-Xmal（CCCGGG）等。