三、组蛋白甲基化酶和去甲基化酶的检测

细胞中组蛋白甲基化酶及去甲基化酶对细胞状态的影响取决于两个方面,即酶的量和酶的活性。针对这两方面有以下检测方法。

(一)组蛋白甲基化酶和去甲基化酶量的检测 1.蛋白水平检测

为明确组蛋白甲基化维持动态平衡的机制以及特定时间的存在状态,需要对HMT和HDM的蛋白水平进行研究。蛋白质的研究通常选用Western blot和酶联免疫吸附实验(ELISA)。两者相比,Western blot价位低廉,适用于组织和细胞内蛋白的定量研究,但敏感性低;ELISA价格昂贵,但可用于存放较久的组织中特定蛋白的定性及定量研究,且所需样本含量小。

2.mRNA检测

可采用RT-PCR对HMT和HDM的mRNA进行相对定量分析。与传统测定方法相比,RT-PCR克服了Northern blot、核糖核酸酶保护实验需要较多的RNA量的缺点,具有较好的敏感性和特异性。通过共价和非共价荧光标记物或者探针插入到PCR产物,在每次PCR循环完成时对其进行分析,结合软件实时分析荧光数据,从而对mRNA转录产物进行定量分析。

(二)组蛋白甲基化酶和去甲基化酶活性的检测

检测酶活性的常规方法是免疫共沉淀技术,基本原理为:首先创造一个适宜的酶作用液态环境(温度、pH和离子环境等),再通过免疫共沉淀技术将目的酶特异性沉淀、分离,然后将目的酶及其作用底物和原料一并加入准备好的液态环境中,给予一定的反应时间,生成目的产物。用SDS-PAGE凝胶电泳分离目的产物,照相并记录结果。目的产物的量与酶的活性呈线性关系。使用软件对照相结果进行分析,得出有关酶活性的结论。

(侯慧媛 王雨生)