第四节　小儿呼吸系统疾病分子生物学进展

一、呼吸系统疾病

呼吸系统感染性疾病及支气管哮喘等非感染性疾病对儿童身心健康影响严重。此外，感染性因素或非感染性因素引起的急性肺损伤，也是严重威胁儿童生命的肺疾病，越来越受到研究人员的重视。

（一）感染性疾病的分子学发病机制

1.细菌感染疾病

由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的结核病（tuberculosis，TB）仍然是当今世界上最普遍的人类传染病之一，被认为是仅次于艾滋病的第二大疾病“杀手”^［1］。结核病的发病是一个多因素综合作用的结果，它的发生、发展和临床结局，不仅受病原体的毒力和环境因素的控制，而且受到机体遗传基因及其多态性的影响。随着人类基因组学的发展以及对于结核病相关遗传因素研究的不断深入，研究人员采用候选基因策略以及全基因组关联分析研究发现了越来越多与结核病易感相关的免疫基因，分别参与宿主对于结核病的固有免疫应答和适应性免疫应答。固有免疫相关的宿主易感基因研究主要包括Toll样受体（Tolllike receptor，TLR）受体家族、溶质载体家族11成员 1（solute carrier family 11 member 1，SLC11A1）以及锚蛋白重复PH结构域1（Ankyrin repeat and PH domain 1，ASAP1），而适应性免疫相关的宿主易感基因研究主要包括白介素12（interleukin，IL-12）、干扰素 -γ（interferon-γ，IFN-γ），以及细胞因子诱导含SH2结构域蛋白（cytokine-inducible Src homology 2 domain protein，CISH）。

TLR家族是一类重要的模式识别受体，共有11个成员，通过识别并结合结核分枝杆菌抗原，募集接头蛋白经不同信号转导途径进行信号转导，激活核转录因子（nuclear factor-kappaB，NF-κB），NF-κB游离并移位到细胞核中，结合到靶向的DNA，与其他转录因子一起协同诱导IL-1、IL-12、IFN-γ的表达。其中，TLR2可识别MTB对蛋白酶抵抗的可溶性成分和MTB胞壁成分（ManLAM），而TLR4可识别MTB对热敏感的膜相关成分。研 究 表 明，TLR2基 因 Arg753Gln（rs5743708）和Arg677Trp（rs6265786）以及 TLR4基因 Asp299Gly（rs49867900）和 Thr399Ile（rs4986791）与结核病易感相关。

SLC11A1蛋白位于静息巨噬细胞晚期细胞腔内，当巨噬细胞吞噬病原体后，转移到吞噬体膜上，并通过改变吞噬溶酶体的内环境（促进吞噬体内的Mn²⁺和Fe²⁺外排），使细菌无法合成防御酶系，最终限制病原体在胞内的繁殖。有研究表明，SLC11A1基因靠近5'的（CA）n微卫星区的改变、第4内含子单个核苷酸的改变、第543密码子的天冬氨酸变为天冬酰胺以及3'非翻译区的TGTG缺失等多态性与结核病易感相关。2017年，来自中国的研究者利用目前最新的Cas9基因编辑系统诱导了低脱靶效应的SLC11A1基因敲入奶牛，获得了具有更好的抗结核病能力的转基因奶牛^［2］。

在炎症反应中，细胞因子通过酪氨酸激酶-信号传导和转录激活因子（JAK-STAT）通路将刺激信号传达到细胞内部，诱导包括CISH在内的多种基因转录。CISH由STAT5诱导产生，并且通过负向调节STAT5活化，抑制炎症反应以及免疫反应。在MTB感染中，CISH对于T细胞分化和活化发挥了重要的调节作用。研究表明，CISH多个位点与菌血症、疟疾和结核病易感相关（-639、-292、-163、+1 320和 +3 415，其中 -292（rs414171）起了关键作用），并且携带rs414171的TT基因型以及 rs809451的GC基因型的儿童患结核病的风险明显升高（分别为野生纯合子的1.78和1.86倍）。

ASAP1可以诱导三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）与腺苷二磷酸核糖基化因子（ADP ribosylation factor，Arf）家 族 GTP 结 合蛋白结合，调节细胞骨架以及膜重构。研究者通过GWAS研究发现ASAP1的rs4733781和rs10956514与结核病易感相关，并且发现当下调该基因表达时，树突状细胞的迁移以及基质降解受损。因此，rs10956514可能通过影响ASAP1基因表达水平，而减弱DC细胞迁移，进而影响宿主抗MTB的固有免疫应答^［3］。

2.病毒感染疾病

（1）流感病毒：

流感病毒是人类感染最常见的病毒之一。干扰素（interferon，IFN）为人类重要的抗感染因子，IFN对病毒的防御反应主要是通过其与IFN受体的结合介导信号通路的激活，导致一系列受IFN调控的基因的表达，生成多种抗病毒蛋白如黏病毒抗性蛋白（myxovirus，Mx），阻断病毒基因的复制，从而保护机体免受感染。人类发挥抗流感病毒重要作用的是MxA型。有研究显示，流感病毒的复制可抑制IFN诱导的MxA蛋白的表达；经IFN-α处理的灵长类细胞，产生的MxA蛋白可有效地控制细胞中流感病毒的复制。由此可见，MxA蛋白是抗感染因子IFN下游重要的抗病毒效应蛋白。有研究表明，不同个体的遗传因素可通过影响MxA基因的表达和转录功能，从而对病毒感染性疾病的发病、IFN的治疗效果及预后产生重要影响。但目前，MxA作用的分子机制比如MxA是以蛋白单体还是多聚体的形式发挥抗病毒作用的，尚待阐明。有学者发现，只有二聚体型MxA才能与甲型流感病毒的核蛋白形成稳定的复合物，从而阻止病毒在初级转录阶段的复制^［4］。

另外，唾液酸（sialic acid，SA）受体是介导人/禽流感病毒感染机体的重要受体，通常以糖苷键形式连接在糖蛋白、糖脂和其他多糖的末端。该受体结合于流感病毒表面血凝素（hemagglutinin，HA）的结构是决定流感病毒宿主特异性的主要因素，结合后经胞饮作用，病毒被吞入宿主细胞内，而后经合成病毒蛋白、组装病毒、出芽等一系列过程导致宿主感染、发病。唾液酸受体末端有两种构象形式——唾液酸α-2，6半乳糖（SA2，6GAL）和唾液酸 α-2，3半乳糖（SA2，3GAL），分别主要识别人流感病毒和禽流感病毒。有研究发现，流感病毒HA蛋白第190位置的突变可以增强该蛋白与人型SA受体的结合力，从而增强小鼠体内H9N2禽流感病毒的复制^［5］。另外，学者们还进行了抗流感新药方面的开发研究。比如，有研究发现，新刺孢曲霉素A、五环三萜类化合物及其衍生物可通过竞争性结合HA蛋白中的SA结合位点，有望成为新型抗病毒入侵抑制剂^［6，7］。另外，以per-O-甲基-β-环糊精为支架所设计的多价化合物可以破坏流感病毒HA蛋白与宿主SA受体蛋白的相互作用，从而阻断流感病毒进入宿主细胞^［8］。

（2）呼吸道合胞病毒：

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是婴幼儿呼吸道感染最常见的病原。感染RSV后多数患儿仅表现为上呼吸道感染，而少数则出现严重毛细支气管炎（毛支）和肺炎，并可进一步诱发支气管哮喘。近年来研究发现，多种细胞因子与RSV疾病的易感性或病情的严重程度相关联。

IL-8主要由单核巨噬细胞产生，在炎症反应中能够招募中性粒细胞，增强其浸润。有研究发现，IL-8 133C/G位点的多态性与RSV疾病的严重程度相关联。另外，IL-1β、IL1-RA、IL-7、表皮生长因子和肝细胞生长因子等炎症标志物的水平也被发现与RSV疾病的严重程度相关。研究发现严重RSV患儿机体产生TNF-α和IL-8的能力下降、且与疾病的严重程度相关；另外，气道中IFN-γ和肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）的减少与婴幼儿RSV毛细支气管炎的严重程度相关。SP中的SP-A与宿主的天然免疫有关，可直接清除病原。有研究发现，SP-A2基因和SP-B基因的多态性与RSV感染的疾病严重程度相关。其他被发现的与RSV疾病的易感性相关的多态性还有CD14（159C/T）、维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）（Thr1Meth；rs10735810）等。但是，也有研究并未发现某些基因的多态性与RSV疾病的易感性或病情的严重程度相关联，学者们认为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）对RSV感染临床转归的影响甚微。

（二）非感染性疾病的分子学发病机制

支气管哮喘（简称哮喘）是儿童时期最常见的慢性气道疾病，在全球范围内严重威胁儿童的健康。20年来我国儿童哮喘的患病率呈明显上升趋势。哮喘因其症状反复，给患儿及家长都带来了较沉重的心理负担。同时儿童哮喘在近年来有趋向于婴幼儿起病的趋势，所以针对其发病机制的研究已成为热点。以下介绍目前普遍认为的可能导致哮喘的分子学发病机制。

1.黏蛋白和肺泡表面活性物质

黏蛋白（mucoprotein，MUC）是呼吸道上皮表面黏液中的主要成分。在正常生理条件下黏蛋白起到维持着黏液的黏弹性和协助纤毛的清除作用。然而在病理条件下过度分泌的黏蛋白致使气道梗阻，是导致哮喘的主要的原因。研究表明在急性哮喘患者中8%有支气管黏液溢。而对导致气道黏液高分泌的原因主要认为有以下几方面：首先是气道原发性损伤导致呼吸道黏液高分泌，随后黏液的增多会导致炎症细胞浸润，炎症介质释放，同时又会引发黏液细胞的增生，如此循环。在此过程中，环境因素导致气道原发性损伤，炎性细胞和炎性因子促进MUC合成增加。另外，有研究表明除上述因素外细胞因子也可诱导MUC分泌：IL-4能诱导MUC 基因表达增强；IL-9，IL-13可直接诱导MUC基因的表达；最近又有作者报道，IL6、IL17可引起原代培养气道上皮细胞MUC5B、MUC5AC基因表达，IL-9、IL-13却无作用。

肺表面活性物质（PS）为一种磷脂蛋白复合物，其作用有维持气道通畅，防止黏液栓阻塞而降低气道阻力，从而起到减缓哮喘症状和防止哮喘发生的作用。肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar type Ⅱ cell，AT-Ⅱ）是合成和分泌 PS 的细胞，同时在哮喘的疾病过程中AT-Ⅱ也是受累细胞之一。研究表明：哮喘患者体内肺泡Ⅱ型上皮细胞发生了结构的改变，并伴有AT-Ⅱ细胞凋亡数量增加，同时在哮喘患者体内检测到了可能诱导AT-Ⅱ细胞凋亡的因素，而这些都会导致PS分泌不足，从而使气道反应性增高，继而诱发哮喘。目前有研究试图采用外援PS弥补哮喘病人PS分泌不足的问题，从而起到缓解哮喘症状从而治疗哮喘的作用。

2.白细胞三烯

白细胞三烯（leukotrienes，LTs）是哮喘发病机制中重要的炎性介质。其作用有加速炎性细胞在呼吸道内聚集，增加黏液分泌；引起呼吸道平滑肌收缩和促进呼吸道相关细胞增殖等作用。其在哮喘的疾病过程中参与了诸多反应，有研究表明LTs中主要的活性物质是半胱氨酰白三烯 C4、D4 和 E4（LTC4、LTD4 和 LTE4）等，在哮喘患者检测LTs的水平发现其高于健康人群，提示在疾病过程中通过抑制LTs分泌的上调可作为控制哮喘病情从而治疗哮喘的靶标，同时LTs也可作为诊断哮喘的标记物。目前以用于治疗的LTs受体拮抗剂-孟鲁司特，正是通过与人体呼吸道中LTs受体结合，从而阻断LTs的病理作用，继而达到治疗疾病的目的。由于其在哮喘治疗中的突出效果《全球哮喘防治创议》计划已将LTs受体拮抗剂作为包括5岁以下幼儿轻度以上持续哮喘患儿的可选择药物之一。

3.哮喘相关基因

目前诸多研究都指向支气管哮喘是一种具有遗传倾向的变态反应性疾病。而与哮喘相关的基因研究也是热点。哮喘是一种多基因相关疾病，加之环境因素在其中交互作用，致使哮喘呈现发病机制复杂、症状类型多样且维持时间长短不一。考虑到基因的多效性和环境因素的作用，目前研究将与哮喘相关的基因分为以下四类：

（1）与免疫调节相关的基因：

包括Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）基因等；

（2）与Th2细胞分化相关的基因：

包括IL-13和程序性细胞死亡4（programmed cell death 4，PDCD4）等；

（3）与呼吸道上皮细胞生物功能和黏膜免疫相关的基因：

包括：Th1细胞型趋化因子CCL5等；

（4）与肺功能、呼吸道重塑和疾病严重性相关的基因：

包括瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道和大脑衍生神经生长因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）。

（三）急性肺损伤

感染性因素和非感染性因素均可引起的急性肺损伤（acute lung injury，ALI），其病理改变是以广泛性的肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞的损伤，细胞因子和氧自由基的释放，中性粒细胞在肺微血管内的滞留和激活，以及微血栓的形成等为特征。重症的ALI即是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），ALI还包括其他综合征，如新生儿或婴儿呼吸窘迫综合征（idiopathic respiratory distress syndrome，IRDS），严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）。

1.肺泡表面活性蛋白

ALI肺泡-毛细管膜的损伤破坏了内皮屏障，造成了肺渗透压的升高、进行性炎症反应和非心源性肺水肿，使肺部气体交换和肺顺应性下降，伴随着肺泡渗出液的形成，造成了肺表面活性物质尤其是肺表面活性物质相关蛋白（pulmonary surfactant-associated protein，SFTP）的失活或缺失。肺表面活性物质（PS）减少和成分改变也是严重肺损伤的一个典型病理特征。研究证实，ALI体内存在内源性SP-A代谢异常，支气管肺泡灌洗液中SP-A异常低下的病人均发展为ARDS，SP-A可作为患者肺损伤程度的指标，并参与ALI和ARDS病理过程的发生与发展。SFTPB的缺乏也可引起婴儿和成人的呼吸窘迫综合征。Sftpb基因敲除的小鼠（Sftpb-/-）出生后立刻出现呼吸衰竭，而保留了一个Sftpb等位基因的小鼠（Sftpb+/-）由于还可表达50%的Sftpb而存活。同时，ALI是新生儿呼吸系统常见危重急症，研究显示，肺表面活性剂可以治疗多种新生儿肺损伤，可作为主要的肺保护制剂使用。

2.急性肺损伤相关基因

ALI/ARDS的病情发展过程，治疗效果以及预后都存在着明显的个体差异，随着对ALI/ARDS的认识不断改善，尤其近年来高通量测序及大规模基因组分析包括快速高通量基因表达、基因定位等生物技术的应用。越来越多的研究显示，基因的多态性与ALI易感性和严重程度有关。涉及的基因包括肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL）、人表面活性蛋白、血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VGEF）、胞质球蛋白激酶轻链基因（myosin light chain kinase，MLCK）、Clara细胞分泌蛋白16（Clara cells secretory protein 16，CCl6）等，但是，基因多态性等位基因在不同人种的频率存在差异，而这种差异也显示了不同人种ALI/ARDS易感性的不同。每种基因可能存在多种多态性，但并非都与疾病有相关性，而且在不同群体中及不同的人种其意义并不相同。因此，目前每一种基因多态性均需要更多的样本量或群体水平去证实，以及更为深入的分子水平的研究以揭示疾病的本质。

3.微小RNA与急性肺损伤

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长约21～25个核苷酸的内源性非编码的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过RNA酶Ⅲ的加工生成，参与基因表达的调控。研究显示，凋亡与ALI密切相关，最新的关于miRNA与Ⅱ型肺泡上皮细胞（type Ⅱ alveolar epithelial cell，AECⅡ）凋亡相关的研究，应用高氧诱导大鼠ALI，在不同的时间点观察细胞凋亡率，应用基因芯片技术和PCR技术来筛选和证实与AECⅡ凋亡相关的miRNA，与H₂O₂损伤前比较，在24小时内有一个显著变化的miRNA表达谱，与凋亡相关的miRNA包括miR-449A-5P、miR-34b/c-5p、miR-200a/c-3p、miR-146A-5P、miR-141-3P等，且基因芯片技术和PCR技术所得结果具有高度一致性。

二、呼吸系统疾病诊断学技术

（一）病原体分离培养技术

1.细菌培养法

细菌培养法是诊断细菌感染性疾病的金标准，由于标本采集困难，培养方法复杂等条件限制，使得细菌阳性培养率低，无法满足目前临床诊断的需要。肺炎链球菌是导致儿童社区获得行肺炎第一大病原菌，据国内研究报道呼吸道感染儿童中肺炎链球菌的分离率为5.1%～40.5%，该菌为苛养菌，培养要求高，需要在含有血液或血清的培养基上生长，再加上抗生素的使用以及标本留取不规范等原因，严重影响了肺炎链球菌的培养阳性率。此外，结核分枝杆菌感染也是导致儿童死亡的重要病原之一，我国有统计显示儿童痰细菌学检查阳性的肺结核患病率仅为12.3/10万，传统培养方法为固体罗氏培养法，耗时长，需4～6周；近几年来快速液体培养系统逐渐应用于结核分枝杆菌的临床检测，1～3周即可获得检测结果，缩短了检测时间并提高了检测敏感性，同时还可以对耐药性进行检测，WHO推荐在有条件的地区逐步启用液体培养，包括低收入国家。

2.肺炎支原体分离培养技术

肺炎支原体肺炎约占儿童社区获得性肺炎的10%～40%，近几年来发病率呈逐年上升趋势^［9］。培养标本来源主要有咽拭子、痰液和支气管灌洗液等。传统的体外培养方法耗时长，培养率低，难以在临床检测中开展。肺炎支原体快速液体培养法24小时后便可根据培养基颜色的变化判断结果，适用于儿童肺炎支原体感染的早期诊断。

3.病毒分离培养技术

病毒分离培养技术是通过病毒感染敏感的组织细胞，并将其分离鉴定出来的一种方法，是诊断病毒感染如流感病毒、呼吸道合胞病毒感染最可靠的证据。但由于病毒分离一般需要1～2周，且阳性率低，约为50%～60%，成本高，因此只能做回顾性诊断，同样不适合临床早期诊断的需要。

（二）免疫学检测技术

1.免疫荧光检测技术（immunofluorescence assay，IFA）

免疫荧光检测技术是用荧光素标记的抗体和相应的抗原形成免疫复合物，借助荧光显微镜观察细胞内相应病毒抗原及其存在的位置。IFA 分为直接法和间接法，其敏感性波动在40%～100%，特异性在86%～99%，可用于各种病毒的检测。目前，免疫荧光检测技术已经是应用最为广泛的呼吸道合胞病毒快速检测技术，已被WHO推荐为快速诊断呼吸道合胞病毒的首选方法。基于间接IFA法推出的商品化免疫荧光检测试剂Chemicon能同时检测RSV、流感病毒A 和B、副流感病毒Ⅰ～Ⅲ型和腺病毒，该方法是一种简单、稳定、敏感、特异的检测病毒感染的方法，但是荧光显微镜特殊仪器限制了其在临床上的应用。

2.酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）

酶免疫测定是将酶催化作用的高效性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种微量分析技术。

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是目前应用较为广泛的诊断细菌和病毒感染的方法之一，具有较高的特异性和敏感性。肺炎链球菌的感染，可通过PLY-ELISA检测尿样中完整形式的肺炎球菌溶血素分子（pneumolysin，PLY），或通过 PsaAELISA检测血清标本中抗肺炎球菌表面黏附素A（pneumococcal surface adhesion A，PsaA）IgG，这两种方法敏感性和特异性都比较好，可作为肺炎球菌性肺炎流行病调查的理想方法。ELISA还广泛应用于肺炎支原体的检测，可分开检测IgM、IgG，其敏感性和特异性均可达到较高水平^［10］。另外，ELISA可应用于病毒如流感病毒、RSV感染后对病毒结构蛋白或患者血清抗体的检测。支气管哮喘患者也可采用ELISA对血清中的常见环境变应原特异性IgE抗体进行定性检测。

EIA还可应用于结核分枝杆菌感染的检测，近年来快速发展的γ干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRAs）采用酶联免疫斑点技术，以结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌靶蛋白（early secretory antigenic target，ESAT-6）和 培养滤液蛋白（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激外周血分离的单个核细胞，检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量；或者采用酶联免疫吸附试验，以ESAT-6、CFP-10、TB7.7抗原刺激全血中致敏T细胞，测定全血中特异性T细胞所释放的IFN-γ水平。IGRAs在确诊结核病患儿中的敏感度可达80%，特异度可达98%。但IGRAs诊断方法的不足是不能区分活动性和潜伏性结核病，也不能区分是近期感染还是既往感染。IGRAs不能作为活动性结核病的确诊依据，只可作为一种辅助诊断方法。

3.其他免疫学检测技术

如光学免疫分析法、免疫层析法及快速测流免疫检测技术等方法也被应用于儿童呼吸系统疾病诊断的各个领域。

（三）分子生物学检测技术

1.核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术的原理是利用特异的探针能与互补的核苷酸序列特异结合，通过测定探针上标记的信号来达到检测目的基因的目的。探针的标记物有放射性核素和非放射性标记物，如地高辛和荧光素等。常用的核酸分子杂交技术主要有Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交（in situ hybridization，ISH）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）以及芯片杂交。在诊断学方面，核酸分子杂交技术可用于直接检测细菌如肺炎链球菌，病毒如流感病毒、呼吸道合胞病毒等的核酸，并可同时做出分型，且其阳性率与IFA大致相同，敏感性也有较好的相关性，是分子生物学中常用的传统基本技术。

2.PCR 技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是在核酸模板、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，该技术可在数小时内对仅有几个拷贝的基因放大百万倍，以其敏感性高、特异性好、检测效率高而迅速发展。常用的方法有实时定量PCR（real time quantitative-PCR，RQPCR）、反转录 PCR（reverse transcription-PCR，RTPCR）和巢式 PCR（nested PCR，NPCR）等，对呼吸道常见致病菌和病毒检测的特异性和敏感性较高，并且可以区分亚型。近年来，随着自动化设备的研发，全自动一体化PCR检测方法在微生物检测领域开始得到应用，节省了人力并展现出更好的稳定性。例如，Genexpert^®系统是基于PCR方法的全自动一体化核酸检测系统，依托该系统的结核分枝杆菌核酸及耐药基因全自动半巢式PCR（Xpert MTB/RIF）扩增检测，已获得欧盟CE认证和我国CFDA认证，并在几十个国家上市销售，帮助快速诊断结核/耐药结核患者，有较高的检出灵敏度和特异性^［11］。

3.恒温扩增技术

核酸恒温扩增技术与PCR类似，其优势在于对仪器的要求较低，在某一恒定温度下实现目标核酸序列的扩增，反应时间进一步缩短，更为“快速简便”，具有较好的发展潜力和应用前景。目前呼吸领域常用的恒温扩增技术包括DNA环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和实时荧光恒温扩增（simultaneous amplification and testing，SAT）等^［11］。例如，针对结核分枝杆菌复合群gyrB和IS6110基因的全自动LAMP扩增技术通过将恒温扩增、实时荧光检测相结合用于结核分枝杆菌复合群快速半定量性检测，具有很好的灵敏性和特异性。

4.候选基因突变的筛查方法

（1）通过分子构象进行筛查：

早先的基因突变筛查主要包括基于单链DNA构象差别来检测点突变的单链构象多态性检测（single strand conformation polymorphism，SSCP）、基于异源双链DNA片段与同源双链DNA片段的差异来检测基因突变的异源双链分析（heteroduplex analysis，HA）和用于检测较大片段基因突变情况化学错配裂解法（chemical mismatch cleavage，CMC）等。

（2）测序技术：

伴随高通量技术和人工智能的发展，DNA序列测序成以其直接、准确、成本合理逐渐成为基因突变检测的主流方法。通过进行DNA的序列测定即读取DNA的核酸序列，不仅可以确定突变的部位，还可以确定突变的性质。第一代测序技术为末端终止法测序技术，由Sanger在 20 世纪 70 年代中期发明；第二代测序技术又被通称为高通量测序技术，推进了基因组相关研究的进展；目前测序技术已经发展到第三代单细胞测序和第四代纳米孔测序，测序在基因突变检测中扮演了越来越重要的角色^［12］。

5.其他技术

如近些年来新近发展起来的基因芯片技术、DNA指纹技术等，已被广泛应用于基因突变的检测、耐药的监测的各个领域。这些方法准确、快速，特异性高，信息量大，临床应用前景广阔。

（申阿东）

参考文献

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