第二节 HLA分型

人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）基因编码的抗原称为人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）。 1952年 Jean Dausset首次报道 HLA-A2抗原，并因此获得1980年诺贝尔奖。1954年，美国约瑟夫·默里医生实施的世界首例纯合双生子间肾移植手术成功，提示HLA相容性在器官移植中的重要性，随后HLA基础研究和组织配型技术得到广泛重视。HLA是调节人体免疫反应和异体移植排斥作用的一组基因，位于第6号染色体的短臂上。HLA抗原可根据不同基因位点的产物和它们的功能加以分类，目前研究较充分的有HLA-A、B、C、DR、DQ 和 DP 等。

HLA抗原可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大类：

Ⅰ类抗原：HLA-A、HLA-B、HLA-C；与移植排斥反应有很强的关联，是经典的移植抗原。

Ⅱ类抗原：HLA-D、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP；这类基因和免疫反应关系密切，故称之为免疫反应基因。

Ⅲ类抗原：C4A、C4B、C2、Bf等补体成分和一些细胞因子，它们的生物学功能也涉及免疫反应。

近几年来，随着大量器官移植临床随访资料的逐渐积累分析，已公认HLA配型对提高肾移植的长期存活率及对抗HLA抗体高敏感患者的肾移植具有重要意义。自环孢素时代开始，新兴的强效免疫抑制剂不断应用于临床，肾移植术后急性排斥反应的发生率大大降低，并使移植肾长期存活率不断提高。由于肾移植受者的个体差异、对免疫抑制剂的耐受程度和抗体致敏的差异等，免疫抑制剂并不能完全杜绝移植肾的急性排斥反应的发生，而良好的HLA配型可降低移植肾的急性排斥发生率。虽然HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子均是主要移植抗原，但这两类抗原在移植中所起的作用是不相同的。在肾移植中，Ⅰ类抗原主要影响长期存活，尤以HLA-B抗原重要。Ⅱ类抗原对长期存活和短期存活均有影响，但以1～3年存活率的影响最明显。尸肾移植中HLA-DR抗原最为重要。在骨髓移植中，HLA分型的精细程度要求更高。除HLA-A、B、DR抗原外，HLA-C抗原、HLADP抗原的影响也是不容忽视的。

1964年Terasaki发明了HLA微量淋巴细胞毒实验方法及相应的组织配型板，1970年被美国国立卫生研究院（NIH）确定为国际通用标准技术，血清学方法成为免疫遗传学和组织相容性研究的基本方法与手段。80年代末期，HLA的研究进入了DNA分型研究阶段。1990年世界卫生组织（WHO）统一了HLA基因分型的命名以及与血清学分型的对应关系，并公布HLA核苷酸序列，为规范HLA分子生物学研究提供了科学的依据。目前已建立了标准化的HLA分型，方法学得到统一。HLA分型方法包括血清学分型和基因分型。血清学分型技术主要侧重于分析HLA抗原的特异性，基因分型方法则侧重于分析基因本身的多态性。

【HLA血清学分型】

1.补体依赖微量淋巴细胞毒试验

补体依赖性淋巴细胞毒试验仅用 1μl抗体、1μl细胞、1μl补体，孵育 1 小时，故称快速微量淋巴细胞毒试验方法。

淋巴细胞具有HLA抗原，在补体存在的情况下，HLA细胞毒抗体（IgG、IgM）能够结合到带有相应抗原的活淋巴细胞膜上，并在膜上打洞致淋巴细胞死亡。死细胞可用数种方法观察，最简单的是染色法。染色液通过死细胞膜进入细胞内，使细胞着色。常用的染料为荧光液和曙红（CFDA和EB）。在荧光显微镜下，活细胞呈绿色（CFDA与细胞膜结合），死细胞呈红色（EB可通过被破坏的细胞膜进入细胞与DNA结合）；在相差显微镜下，活细胞因不被着色而明亮，死细胞由于曙红进入细胞而色暗无光。

T和B淋巴细胞上都有HLA-A、B、C抗原，检测这些抗原可直接用淋巴细胞。但是某些HLA-A、B、C分型血清中同时存在DR抗体，所以，为了避免DR抗体可能造成的干扰，通常用T淋巴细胞作A、B、C分型。近几年，HLA单克隆抗体的出现，可避免DR抗体的影响，而可用总淋巴细胞检测HLA-A、B、C分型。HLA-DR、DQ抗原存在于B淋巴细胞上。所以，测定HLADR、DQ抗原时，需从总淋巴细胞中分离出B淋巴细胞进行测定。

2.血清学分型技术的局限性

尽管血清学技术对HLA-Ⅰ类抗原分型结果有较高的准确性，提供了组织配型的基本手段，并有力推动了HLA研究的发展。但血清学方法也存在诸多的限制。

（1）随着分子生物学技术的发展，对HLA分子结构与核苷酸序列分析研究的深入，每年都有许多新的等位基因特异性被发现和确定。血清学方法已经无法获得能够分辨出所有特异性的标准抗血清。

（2）HLA等位基因序列的高度同源性，使血清学出现较多、较强的交叉反应，影响了分型结果的准确性，并给亚型的进一步确定带来困难。如B40、B48同时存在时，确定 B60、B61、B48较为困难，常常只能根据不同人群种族与地域的抗原频率分布高低来判断。存在B62时，B71就难以分辨出来。A19分裂子的判断也常常出现误差。

（3）分型血清本身的问题：①Ⅱ类分型血清一般比较弱，容易出现假阴性反应；②相当多的Ⅱ类分型血清是用血小板吸收去除Ⅰ类抗体的方法得到的，可能造成抗体效价的下降，同时残留的Ⅰ类抗体也可以干扰分型结果。

（4）HLA-C抗原血清学分型，至今缺乏理想的单特异性的抗血清。

（5）血清学方法检测的是淋巴细胞膜表面的HLA表现型。血清学的表型相同，DNA核苷酸序列不一定完全相同。HLA的个体遗传学差异的本质不是在血清学方法所检测的基因产物上，而是在编码基因产物的DNA水平上。

（6）淋巴细胞膜抗原的表达受多种因素的影响与干扰。最近的研究显示：膜上的HLA抗原有可能被遮盖或表达能力下降。如HLA-C抗原等位基因序列目前血清学尚不能分辨，淋巴细胞膜表面C抗原表达只有A抗原或B抗原的10%。

（7）HLAⅡ类抗原主要在B淋巴细胞表达，血清学分型较Ⅰ类A、B抗原误差率更高。

（8）目前用于血清学分型的抗血清或单克隆抗体，主要依据白种人群的HLA背景与频率分布特点而定，中国人的标准抗血清很少。因此，源于白种人群的血清学分型用于非白种人群的检测，本身就存在一定的误差。

（9）标准抗血清或单克隆抗体的筛选技术复杂，难度大，试剂来源受到限制。

（10）血清学需要活的淋巴细胞，对于特定条件下的尸体移植，样本的来源受到一定的限制。

【HLA基因分型】

HLA基因分型是在编码基因产物的DNA水平上进行的，自20世纪90年代以来发展十分迅速，在临床器官移植的组织配型中得到实际应用。HLA基因分型方法很多，各有其特点。目前常用的方法大致可分为8大类。

1.限制性片段长度多态性分析（restricted fragment length polymorphism，RFLP）

RFLP方法的基本原理与技术是根据HLA（主要是Ⅱ类抗原）的核苷酸序列，在不同部位存在多个不同的酶切位点，利用核酸内切特异性消化和切割这些位点，形成各种大小不等的DNA片段，经电泳分离再转移到硝酸纤维素滤膜（NC膜）上，与cDNA探针杂交，采用放射性自显影技术观察分型结果。

目前已建立起以PCR技术为基础的PCR-RFLP分型技术，用于 HLA-DQA1、DQB1、DPB1、DRB1 和 HLA-B44 亚型、HLA-C分型的方法。但复杂的分型方法学和复杂的结果判断程序，限制了PCR-RFLP技术的广泛应用。如检测的多态性位点，必须正好处于酶切位点上才可分辨，否则无法检出。对具有高度多态性的等位基因，如对DRB1及杂合体进行分型时，所获酶切图谱复杂，需用多种内切酶才可分辨，且不能提供高分辨的分型结果，在这种情况下，与PCR-SSP或组特异性扩增的方法联合使用较为合适。

2.聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法（PCR with sequence-specific oligonucleotide probe，PCR-SSO）

PCR-SSO 方法是目前较常用的DNA分型技术之一。主要技术包括提取模板DNA，以位点间或组间特异性引物进行PCR扩增，将其产物转移到NC膜上，再与数十个寡核苷酸特异性探针杂交，从而分辨出等位基因的特异性。SSO分型除存在杂交污染外，与SSCP一样，并不能对所有等位基因多态性做出精确的分辨。PCRSSO具有灵敏度高、特异性强、所需样品量少、方便等优点。到目前为止，各国学者设计的探针可用于检测几乎所有目前所知HLA等位基因。但随着新等位基因的不断发现，就需要越来越多的探针和杂交次数。其缺点包括操作费时，影响因素多，技术要求高，不能进行单倍型分析等。

3.聚合酶链反应单链构象多态性分析（PCR with single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）

PCR-SSCP 方法原理可概括为：在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链DNA因碱基序列不同所形成的构象不同，泳动速度也不同。通过PCR扩增包括发生单个碱基置换部位及两侧DNA片段，变性后进行SSCP分析，可分辨出单个碱基的改变，有效地检出点突变和DNA的多态性。主要步骤包括PCR扩增，产物酶消化切割，热变性为单链DNA，电泳后染色观察结果。主要应用于检测癌基因的突变和HLA多态性。在要求精确配型的异基因骨髓移植中，PCR-SSCP已初步显示出优越性。但在实质性器官移植的临床配型中，如同RFLP一样，构象分析的主要问题也是检测技术与结果的判断程序太复杂，影响了该项技术的实际应用。该技术是1989年日本Orita等人建立的一种检测点突变的新技术，曾成功地检测了肺癌患者的ras突变基因。PCR-SSCP可检测DNA片段中不同位置的点突变，而不必像PCR-RFLP那样要求目的基因必须含有限制性内切酶的识别位点；或PCR-SSOP要求等位基因间的差异正好在与探针杂交的序列中。该方法具有较高识别力和敏感性，对于分析小于400bp的PCR扩增产物十分有效。但在PCR-SSCP分析中，电泳温度、凝胶总浓度和交联度、电流强度等诸多因素会影响其识别力，因此在实际HLA分型中应用较少。

4.DNA测序分型技术（PCR-SBT）

PCR-SBT的原理是：首先用PCR扩增获得DNA片段，然后采用测序反应获得扩增片段的碱基序列。由于获得了扩增片段全部碱基序列，故该方法是最可靠的基因分型方法。它不仅能进行序列识别和分型，更有助于发现新的基因型。目前只有通过测序才可准确证实新发现的HLA等位基因。已有报道，血清学结果为空白或PCRSSP和PCR-SSOP未能检出或几种分型结果不一致时，均可通过SBT技术获得准确、可靠的高分辨结果。

PCR-SBT之所以优于PCR-SSP和PCR-SSO，主要在于它能分析包括非多态性位点在内的整个基因组序列，且PCR-SBT不但可以对DNA测序，也可对cDNA测序来分析基因的表达。随着DNA测序技术的普及，该方法越来越受到重视。PCR-SBT无论在分型精确度、工作效率还是自动化程度都明显优于其他几种分型方法，目前已有专门的HLA分型软件与自动上样的固相测序试剂盒，而且测序费用大大降低。因此，PCR-SBT是科研工作中最理想的HLA分型方法，随着自动核酸测序成本的降低，这一分型技术将被广泛应用。

近年来，新的测序技术层出不穷，纷纷运用到HLA分型中。如MSNE（multiplex single nucleotide extention）应用链中止法原理，根据等位基因SNP位点设计特异性引物和生物素荧光标记的ddNTP进行分型，具有重复性好，可分辨杂合子等优点，已应用到HLA-A位点的分型中。又如焦磷酸测序技术分辨率好，可分辨杂合子，自动化程度也高。

焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是2003年应用于HLA基因的高通量高分辨分型的系统，是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。其基本原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶的协同作用下，将引物中每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的，因此是一种合成测序并实时监测的分型技术平台。焦磷酸测序技术一次能够分析70bp或更长的DNA序列，具备如下优点：①不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素。②10分钟内可分析96个样品的SNP，可满足高通量分析的要求。③每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活。④序列分析简单，结果准确可靠。在分型中有一定的临床应用前景。

5.序列特异引物聚合酶链反应技术（PCR with sequencespecific primers，PCR-SSP）

根据HLA抗原的核苷酸序列，设计出一系列针对各亚型的顺序特异引物，通过PCR扩增各等位基因的型别特异性DNA片段；扩增产物借助常规的琼脂糖凝胶电泳，即可根据是否存在特异性扩增产物的电泳条带直接进行分型。本法是目前大多数医院所采用的HLA基因分型方法。其主要特点有：第一，高特异性与敏感性。本方法具备PCR技术的高敏感性，所需临床样本量极少，引物是针对各亚型等位基因的碱基序列所设计的，从PCR的第一个循环开始即是特异性扩增；高出常规PCR技术10℃以上的退火温度又加强了这种特异性。分型结果的确定性鉴定证实其特异性好。第二，简捷、快速的分型方法。本方法扩增的处理过程仅需借助常规的琼脂糖凝胶电泳，结果判断仅根据是否存在特异性扩增产物的阳性条带而定。因此，整个分型过程十分简捷快速，可在几小时内完成（一般3小时左右），结果判断非常容易。第三，适合的分辨水平。本方法可以根据不同的研究目的，设计高分辨度和低分辨度的引物，满足不同的配型要求。而且，随着对各亚型等位基因核苷酸序列的了解，可以随时设计分辨度更加精细的引物。第四，适合于临床应用。鉴于本方法快速、准确，所需样本量少、要求低（全血、淋巴细胞和少许脾组织均可）。因此，非常适合于临床应用。

目前对所有HLA-Ⅰ类、Ⅱ类抗原的PCR-SSP分型均已获得成功，并可同时一次性完成 HLA-A、B、C、DRB1、DRB2、DRB3、DRB4、DRB5和DQB1等位基因的分型。整个分型时间可控制在3小时左右。PCR-SSP技术的显著特点是结果容易判断、根据实际需要调整分辨度水平、分型速度快，特别适用于尸体移植。上海长征医院配型中心已采用本法配型多年，也是我国各大器官移植中心采用最广泛的、最普遍的HLA分型方法。

6.应用寡核苷酸芯片技术进行分型

基因芯片技术由美国Affymetrix公司首先开发。其原理为反向斑点杂交，即通过点样仪将成千上万个代表不同基因的寡核苷酸探针点样于固相支持物表面，这些探针可与放射性标记物或荧光素标记的样品DNA或cDNA互补核酸序列相结合，通过放射自显影或荧光检测，杂交结果经过计算机软件处理分析后获得杂交信号的强度及分布模式图，从而反映样品中基因表达的情况。对于HLA分型来说，理论上可以实现在一块芯片上同时探测A、B、DR、DQ等所有已知的多态位点，是一种理想的高效的检测配型手段。

与现有的其他分型技术比较，基因芯片分型有如下优势：①具有集成化的优点；②操作非常简便，结果判读通过荧光扫描，而不是凝胶电泳，大大简化了操作，缩短了时间；③灵敏度高，芯片通过2级放大，第1级是在PCR扩增模板DNA时，第2级是在读取杂交结果时荧光素的2级放大，大大提高了灵敏度；④效率高，只需要1张芯片，1次PCR，1次杂交就可以对多个样本进行HLA-A、B、DR、DQ等位点DNA分型；⑤标准化程度高，采用多种、多点、同步杂交法检测靶基因和自动化分析结果，可确保检测特异性和客观性，最大限度减少人为误差；⑥成本较低，由于芯片制作和检测的自动化程度较高，并且固定在芯片上探针量和PCR所用的样本量很小，芯片可以实现单片多人用，由此使检测的成本降低。这些会促使HLA基因芯片分型技术在临床上得到广泛应用。但是，目前基因芯片还存在仪器设备昂贵，方法有待标准化以及信号检测低等问题，相信这些问题会尽快得到解决，一旦这种高效的分型方法用于临床，必然会带来巨大的经济与社会效益。

7.流式细胞仪（FLOW-SSO）分型

美国One Lambda公司于2000年3月开发出FLOW-SSO HLA DNA配型产品，即LABMASTM（序列微珠结合分析实验系统）。利用传统的SSO原理，标本首先进行非特异性扩增，扩增产物经解链后，与包被了特异性HLA DNA探针的微珠结合，经过缓冲液冲洗，加彩色荧光素染色后，在流式细胞仪中检测，分析在微珠表面的SSO探针与DNA标本之间的反应，即可获得HLA分型结果。这是基于荧光流式细胞仪和免疫标记技术相结合的一项新的免疫学技术。它有机地整合了有色微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则。微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球，每种颜色的微球可以携带一种生物探针，探针通过羧基结合到微球表面，因此1个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应。通过鉴定微球的颜色来确定反应类型，而对反应的定量分析是通过靶物质上的报告分子完成的，能够实现应用1个试剂同时检测1份标本中1～100个指标，极大地简化了临床检测程序，减少了临床检测成本，同时保持了荧光流式细胞仪所具备的准确、敏感、特异和重复性好以及快速出结果等优点。

在HLA分型方面，该系统具有较为明显的优势，HLA-A、B、DR分型实验可以在一个单独的管内完成。LABType利用LABMASTM和“all in one”反应，大大降低了实验的工作量和试剂的耗费量，检测结果准确（没有任何条带、膜控制，没有比色反应），无需用肉眼分析判断结果，省时省力，适用于骨髓库、脐血库的HLA配型及工作量较大的HLA配型实验室。

8.reference strand conformational analysis（RSCA）分型系统

RSCA分型的基本原理为根据不同基因扩增产物与荧光标记参照链（FLR）杂交后产生具有不同构象的稳定DNA双链，经过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳后，采用激光扫描技术以及计算机相关智能软件分析技术来检测和分析HLA等位基因。RSCA技术的特点在于融测序与构象分析于一体，弥补了单测序或单构象分析的各自缺陷。用RSCA所测的结果稳定、准确、分辨率高、重复性更好。此外，RSCA既可以发现新的等位基因，又能确定新基因的方向，所用仪器也可用于直接测序，从而使一台仪器可以用于两种分型方法，既可以增加分型准确度，又降低了分型成本。但目前，RSCA仍有许多尚未解决的问题，对于不同的等位基因选用哪一种参照链需要更进一步的实验；结果中杂交双链峰值的荧光强度由标本的PCR产物决定，如果标本的PCR产物少，则结果难以确定，有时需要用其他的分型方法确定。上述缺陷可通过改变RSCA试剂和改进计算机分析软件来解决。

综合DNA分型与血清学分型结果，结合我国器官移植的实际情况，建议：

（1）HLA-Ⅰ类A、B抗原分型仍以血清学方法为主，尤其是大样本量的检测，如建立“骨髓库”，更适用于血清学分型作为初步筛选。对于血清学分型困难、空白或交叉反应明显，影响亚型确定者，有必要采用DNA分型作进一步确认。

（2）HLA-Ⅱ类抗原尤其是DR抗原分型，推荐采用DNA分型技术取代血清学方法。

迄今为止，借助血清学分型技术，已经确定的HLA基因产物即血清学抗原共有139个，其中A位点基因编码的抗原有28个，B位点有62个，C位点有10个，DR位点有24个，DQ位点有9个，DP位点有6个。WHO最新公布的HLA血清学和细胞学特异性见表4-2。某些基因的频率在不同种族之间差别也很大，少数HLA特异性只见于某些种族。

寻找供受者HLA六种抗原完全相同的概率较低，可以根据某些HLA抗原具有相同的抗原特性进行挑选。表4-3就是将含有相同抗原特性的抗原划分到同一组。如：A10抗原被细分为 A25、A26、A34、A66 四种抗原。

临床HLA配型常规检测的HLA抗原有100多种。在这100多种抗原中，供者与受者HLA抗原相同的概率很低。许多HLA抗原在分子结构上具有相同部分，称为公共抗原决定簇，即某些抗原因为分子结构接近，而发生与某一抗体的交叉反应，这些抗原被称为交叉反应组（cross reactive group，CREG）。大量临床数据表明，在同一组中，即使供者和受者的抗原不同，其发生移植后免疫排斥的概率明显低于非同一组中的HLA抗原错配，而器官移植存活率也明显高于随机HLA抗原错配的患者。因此，有人称此为可接受错配。利用HLA抗原具有相同的抗原决定簇进行归类，称为交叉反应组配型。比较认同的交叉反应组配型见表4-4。

临床研究证实，按HLA交叉反应组配型选择供受者可以获得较理想的移植效果，适合于我国尸肾移植的临床应用。随着免疫机制研究的深入，不同人种的HLA交叉反应组配型标准的确立，以及在各种组织和器官移植中的临床应用，必将进一步完善交叉反应组配型标准，显示出越来越重要的临床价值。