第六节　荧光分析方法

一、常规分析方法

（一）直接测定法

利用物质自身发射的荧光进行测定分析。许多有机芳香族化合物和生物物质具有内在的荧光性质，往往可以直接进行荧光测定。对于这些本身发荧光的被测物，可以通过直接测量其荧光强度的方法测定其浓度。当然，若有其他干扰物质存在时，则应预先采用掩蔽或分离的办法加以消除。

在实际操作中，最常用的定量方法是工作曲线法或直接比较法。为了使不同时间所测得的工作曲线先后一致，应用过程中要校正。如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则须改用另一种稳定而且荧光峰相近的标准溶液来进行校正。例如测定维生素B₁时，用硫酸奎宁为基准；测定维生素B₂时，用荧光素钠作为基准。

（二）间接测定法

间接测定法适用于本身不发荧光，或者因荧光量子产率很低而无法进行直接测定的样品。间接测定的方法有多种，可根据分析物质的具体情况加以适当的选择。

1.荧光衍生法

荧光衍生法可分为化学衍生法、光化学衍生法和电化学衍生法。分别通过采用化学反应、光化学反应和电化学反应，使不发荧光的分析物质转化成发荧光的适合于测定的产物，然后，实现间接测定被分析物质。例如，许多无机金属离子的荧光测定方法，就是通过使它们与某些金属螯合剂反应（也称为荧光试剂），生成具有荧光的螯合物之后再间接测定金属离子含量而进行的测定。

通过利用氧化还原反应、光化学反应、降解反应、缩合反应等办法可以使某些不发光的有机化合物转化为荧光物质。例如：叶酸本身荧光很弱，用KMnO₄氧化叶酸，其氧化产物蝶呤-6-羧酸能发荧光。通过测定叶酸氧化产物蝶呤-6-羧酸的荧光强度，可间接测定叶酸的含量。并且较直接荧光分析法测定叶酸的灵敏度提高12.5倍。

2.荧光猝灭法

某些情况下，虽然被分析物质本身不发荧光，但却能使某种荧光化合物发生荧光猝灭，并且荧光猝灭的程度与被分析物质的浓度存在定量的关系。因此，通过测量荧光化合物荧光强度的下降程度，能够间接测定被分析物质含量。利用这一性质建立的荧光测定法，称为荧光猝灭法。荧光猝灭法在化学、医药、食品安全、环境科学及生化分析中有着广泛的应用。

在药物的荧光分析中，应用静态猝灭法研究第三代头孢新药盐酸头孢吡肟、头孢匹胺和头孢唑钠与人血清白蛋白和牛血清白蛋白的作用，并计算了它们的结合常数。（血清白蛋白为荧光剂，药品为猝灭剂）。

在食品安全检测中，基于硼砂对姜黄素的荧光猝灭作用，测定食品中的硼砂含量；应用微波消解荧光猝灭法测定奶粉中的微量硒；应用异丙肾上腺素体系荧光猝灭法测定食品中的痕量锰等。

利用酪氨酸作为荧光探针研究酪氨酸与DNA的相互作用，通过荧光猝灭法发现酪氨酸与鲑鱼精子DNA（SM DNA）是以沟槽模式结合；对羟基苯丙酮酸含量是确定先天性代谢紊乱的重要标志物，利用对羟基苯丙酮酸在一定条件下对色氨酸的自体荧光的显著猝灭作用，可用于血清中的对羟基苯丙酮酸含量的测定。

利用磷化物与罗丹明形成配合物从而猝灭罗丹明的荧光的特点，可以用猝灭法测定水中痕量磷。

荧光猝灭法比直接荧光法灵敏度更高、选择性更好。

3.敏化荧光法

敏化荧光法是建立在受光激发的分子与另一种分子碰撞时，把激发能传递给另一个分子使其激发，后者再以辐射形式去激发而发射荧光，即为敏化荧光。

利用敏化荧光法，对不发荧光的被分析物质，可以通过选择合适的荧光试剂作为能量受体，在待测物质受激发后，通过能量转移的办法，经过单重态-单重态（或三重态-单重态）的能量转移过程，将激发能传递给能量受体，使能量受体分子被激发，再通过测定能量受体所发射的荧光强度，即可以对分析物进行间接测定。

对于浓度很低的待测物，往往由于荧光信号太弱而无法采用一般的荧光测定法检测。假如能够寻找到某种合适的敏化剂（能量供体），在敏化剂与被分析物质紧密接触的情况下，敏化剂被激发后，在敏化剂与被分析物质之间的激发能转移效率很高，这样能大大提高被分析物质测定的灵敏度。

（三）多组分混合物的荧光分析

分子荧光分析法可同时测定或选择性地测定混合物中某种组分。这是由于荧光化合物都具有荧光激发光谱和发射光谱，在测定时相应地有激发波长和发射波长两种参数可供选择。

当混合物中各组分的荧光峰相距较远、彼此干扰很小，可分别在不同的发射波长测定各个组分的荧光强度。若混合物中各组分的荧光峰相近，彼此严重重叠，而它们的激发光谱却有显著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定。

当分别选择激发波长和发射波长仍无法满足混合物中各组分的分别测定时，还可通过联合测定并解联立方程式的办法。

除上述两方法之外，还可以利用某些化学方法以达到同时测定的目的。例如用不同的化合物在不同pH介质中荧光性质不同的特点，分别测定不同pH试样溶液的荧光强度。例如，吗啡和可待因的激发峰均在285nm，荧光峰均在350nm。吗啡在pH值为1～3的溶液中荧光强度最大，而在pH为10～12的溶液中荧光几乎完全消失；可待因在pH为1的溶液中的荧光强度约和同浓度的吗啡溶液相等，而在碱性溶液中荧光强度并不减弱。据此，可先将混合物试样溶液的pH调节至1，在350nm测定荧光强度以求出混合物中吗啡和可待因的总量，然后调节溶液pH=12，测定荧光强度以求出可待因的含量。最后由两者的差值求出吗啡的含量。

在混合物的荧光联合测定中，更为先进的方法有同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定和化学计量学的方法等，以此来达到分别测定或同时测定的目的。

二、同步荧光分析法

同步荧光分析法（synchronous fluorescence spectrometry）是多组分混合物荧光物质测定的有效手段之一。它比常规荧光分析法谱图简单、选择性高、光散射干扰少。同步荧光扫描技术与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长）构成光谱图，称为同步荧光光谱图。荧光光谱与同步荧光光谱是不同的，两者之间的差异如图8-5所示。

在同步扫描荧光测定中，同步荧光的信号强度I_sf（λ_ex，λ_em）可表示如下：

式中，c为待测物质的浓度；b为试样溶液的厚度；Ex（λ_ex）表示激发光谱；Em（λ_em）表示发射光谱；k为实验的条件常数。由（式8-8）可知，对于某种待测物质，在实验条件保持一定的情况下，同步荧光信号的强度与待测物质的浓度呈正比。

（一）恒波长同步荧光分析法

恒波长同步荧光分析法（constant-wavelength synchronous fluorescence spectrometry，CWSFS）就是在扫描过程中，激发波长与发射波长之间保持固定的波长间隔（Δλ=λ_em-λ_ex=常数），也就是通常所说的同步荧光法。在恒波长同步荧光法中，Δλ的选择十分重要，这会直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度。在可能条件下，选择等于斯托克斯位移的Δλnm。恒波长同步荧光法可有效克服瑞利散射的影响，若光谱扫描过程中发射波长和激发波长维持足够的间隔，就可完全避开瑞利散射的影响。

同步荧光光谱法较多用于多组分多环芳烃的同时测定。多环芳烃性质很相似，尽管有强的荧光，但各种化合物的激发光谱和发射光谱往往重叠严重，用经典荧光法难以进行混合物的直接分析。同步荧光法具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特点，可用于多组分多环芳烃混合物的同时测定。恒波长同步荧光光谱法除应用于多环芳烃的分析外，还常用于药物分析和蛋白质、氨基酸测定。

例如苏丹红Ⅱ和苏丹红Ⅲ的同时测定。苏丹红Ⅱ和Ⅲ属萘酚偶氮染料，溶液中苏丹红Ⅱ和Ⅲ激发光谱和荧光光谱存在严重的重叠（图8-6a），常规的荧光法无法对它们进行同时测定。而苏丹红Ⅱ和Ⅲ的同步荧光光谱重叠程度减少（图8-6b），无须预分离，通过选择适当的波长差，只须一次扫描就可实现恒波长同步荧光法同时测定苏丹红Ⅱ和Ⅲ。

（二）恒能量同步荧光分析法

恒能量同步荧光分析法（constant-energy synchronous fluorescence spectrometry，CESFS）是在激发波长λ_ex和发射波长λ_em的同时扫描过程中，两者保持恒定的能量差Δν关系［Δν=（1/λ_ex-1/λ_em）×10-7=常数］。CESFS以荧光体的量子振动跃迁的特征能量为依据进行同步扫描。选择能量差Δν值等于振动能量差，则在同步扫描中，当激发能量和发射能量刚好匹配特定的吸收-发射跃迁条件时，该跃迁处于最佳条件，由此产生的同步光谱峰可达最大强度。

CESFS的理论比CWSFS简单，可得到较为精确的光谱峰值位置、强度、半峰宽度的计算式。此法除了具有CWSFS的一般优点外，还具有另一个显著的优点是能从根本上解决拉曼散射的干扰问题。这是其他同步法所不能达到的。

CESFS特别有利于多环芳烃的鉴别和测定。方法的光谱优点非常突出，可以以定量形式来表达并用来选择扫描参数，从而为体系的参数优化提供了便利。该法可应用于空气样品中多环芳烃的光谱指纹鉴别、汽油机废气中多环芳烃和苯酚的分析。也用于多种多环芳烃的测定，绝对检测限低，线性动态范围宽。

（三）可变角同步荧光分析法

可变角同步荧光分析法（variable-angle synchronous fluorescence spectrometry，VASFS）在测绘同步光谱时，使激发和发射两个单色器以恒定的波长但是不同的速率或方向同时扫描得到三维荧光光谱。与恒波长同步荧光相比，可变角同步荧光法具有合并谱图的特点，可减少扫描次数，达到快速测定的目的。

VASFS可分为线性与非线性两类。线性可变角同步荧光法的扫描路径表现在等高线图中是一条不为45°的直线；而非线性可变角同步荧光法的扫描路径表现在等高线图中为折线或任意曲线。非线性可变角同步荧光扫描时，要求激发、发射两个单色器能以不同的速率和不同的方向进行扫描。此法能使扫描路径方便地有选择性地通过各点因而获得非常好的光谱分辨。

应用非线性可变角同步荧光法，最重要的一点是测定前选好测定扫描路径，而选择最适宜的扫描路径，可以获得最好的非线性可变角同步荧光光谱，即得到最高的荧光信号、最小的干扰。

VASFS应用于药物、多环芳烃、维生素、氨基酸、除草剂混合物等样品含量的分析。如用导数可变角同步荧光分析技术分别测定水样中1-萘酚和2-萘酚、苯酚和苯胺、苯胺和1-萘酚的混合物。

（四）恒基体同步荧光分析法

恒基体同步荧光分析法（matrix isopotential synchronous fluorescence spectrometry，MISFS）被认为是非线性可变角同步荧光分析法的一种，其扫描路径在等高线图中表现为一曲线，该曲线是基体（将干扰物视为基体）的等荧光强度线。将MISFS与导数技术联用，沿着等高线扫描，再结合导数技术就可以消除基体的干扰。

选择合适的扫描路径是恒基体同步荧光测定的关键。例如，粪卟啉和原卟啉的同时测定。粪样中卟啉的分型测定可以为卟啉症分类诊断提供重要依据。分别假设原卟啉和粪卟啉为干扰组分。扫描另一组分的三维荧光谱图，将两条路径连接起来就构成一条完整的扫描路径。结合导数技术之后，在前一段扫描就可以消除原卟啉的信号，而得到粪卟啉的净信号。同样地，在后一段扫描时，则可得到原卟啉的净信号。因此，只须一次扫描就可实现粪卟啉和原卟啉的同时测定。

（五）同步荧光分析法的应用

同步荧光分析法对于提高分析选择性，解决多组分荧光物质同时测定具有良好优势。并且最早发展起来的恒波长同步荧光分析法在一般的荧光分光光度计上均可方便实现，已经在环境、医药、卫生和生物等领域获得广泛的应用。近期，带有恒能量同步扫描功能的商品化荧光分光光度计业已出现。同步荧光分析仪器的普及将进一步促进同步荧光技术在各分支领域的发展和应用。

三、时间分辨荧光分析法

前面讨论的荧光分析法大多是利用荧光强度和荧光波长之间关系的荧光光谱信息而建立的分析方法。然而在荧光发射过程中还有它的寿命信息。时间分辨荧光分析法也叫时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是建立在荧光强度与时间的变化关系上的方法。当用很短的脉冲光激发荧光体时，形成激发态荧光分子的群体，激发群体随时间而衰变，其衰变率为：

式中，N_t为激发后t时的激发态分子数目；N₀为激发态的总数目；τ为激发态分子的平均寿命；t为时间。在t时的荧光强度F_t则为

通过测量荧光强度随时间的变化，便可以用lnF_t对t作图（图8-7b）。从线性的斜率求得荧光体的寿命τ，从截距求得F₀，它与荧光物质的浓度呈正比。

用脉冲法测量荧光的寿命，必须对荧光强度随时间的衰变进行测量（图8-7a）。近年来广泛应用激光光源的时间分辨荧光计。随着激光技术和检测技术的进步，时间分辨检测下限达到飞秒（10-15s）数量级。

时间分辨荧光分析法已应用于以下几个方面：金属配合物荧光寿命的测定；混合荧光体中两组分的同时测定；痕量分析中干扰物与背景荧光的消除；多环芳烃的检测；芳基的检测；溶剂松弛时间的分辨测量；等等。例如，混合物A、B的同时测定，当荧光体混合物中两组分的荧光寿命之差超过4纳秒时，混合物中两组分可以通过荧光衰变曲线进行同时测定。如图8-8（a）所示，分别为两种荧光物质A、B及A和B混合物的相对荧光衰变曲线。

由lnF_（t）对t作图得到图8-8（b），其中曲线“1”和“2”分别是荧光物质A和B标准溶液的荧光强度的对数衰变曲线，均呈直线，截距分别为lnF_A（0）和lnF_B（0）；曲线“3”为A和B混合物溶液的荧光强度对数衰变曲线，因含两种荧光混合物，所以对数衰变曲线弯曲。但在达到一定时间后，寿命短的荧光组分B的荧光强度衰变趋于零，长寿命组分A占主要优势而呈直线，其斜率和曲线“1”一致，把这段直线延长至零时间（虚线），得到混合组分中A荧光强度对数曲线的截距lnF_Ax（0）。根据lnF_Ax（0）、lnF_A（0）和荧光物质A标准溶液的浓度可计算出混合组分中的荧光物质A含量。根据lnF_Ax（0）计算出不同时间混合组分中的荧光物质A荧光强度F_Ax（t），从混合物的荧光强度F_Ax+Bx（t）中扣除F_Ax（t），由ln（F_Ax+bx（t）-F_Ax（t））对t作图得到短寿命组分B的荧光强度对数衰变曲线。根据lnF_Bx（0）、lnF_B（0）和荧光物质B标准溶液的浓度可计算出混合组分中的荧光物质A含量。

时间分辨荧光分析技术主要有如下方面的应用。

1.蛋白质定量分析

利用生物素-链霉亲和素的高亲和力将Eu3+标记β-淀粉样蛋白分泌抑制因子的单克隆抗体来测量稳定转染的人神经胶质瘤细胞系H4细胞分泌的β-淀粉样蛋白分泌抑制因子。

2.酶活性的检测

均相时间分辨荧光分析技术可以测量端粒酶活性，还可利用该分析系统高效检测羧肽酶B活性。

3.基因分析

使用镧系离子螯合物标记等位基因特异探针来筛选新的基因标志。

时间分辨荧光分析技术优点突出，发展迅速，应用日益广泛。随着生物技术的发展和对微量检测要求的提高，具有多种特殊优点的时间分辨荧光技术将在更多领域内得到应用和发展。

（管春梅）