第七节　单分子荧光检测技术

单分子检测（single molecule counting，SMC）是20世纪80年代迅速发展起来的一系列超灵敏的检测技术。SMC是对溶液样品中的特定种类单个分子进行检测和统计，从而对溶液浓度进行检测的定量方法。近年来，单分子检测技术取得了重要进展，并为生命科学的发展，开辟了全新的研究领域。

单分子荧光检测技术是根据标记在生物大分子上各个荧光基团的各种特性变化，反映相关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性改变的信息，是对微观个体的测量，探测分子个体的行为和特征。普通光谱技术检测的是大量分子的综合平均效应，得到的是系统的平均响应和平均值，掩盖了许多特殊的信息。而单分子光谱研究可以排除系统的平均效应，有利于复杂环境中同种分子不同行为的分析。通过对体系中单个分子的研究从而得到单分子体系的动力学过程。目前，单分子研究不仅可以在溶液中对单个分子进行检测和成像，还可以通过对单分子的光谱性质进行测量，从而对化学反应的途径进行实时监测，特别是能对生物大分子进行探测，并提供分子结构与功能之间的信息。单分子检测有电化学法和光学法，单分子荧光检测（single molecule fluorescence detection）是单分子检测中最常用的方法。

一、单分子荧光检测原理与荧光特征

单分子的光学探测可由频率调制的吸收光谱和激光诱导荧光检测，因其背景低、信噪比高，激光诱导荧光（laser induced fluorescence，LIF）成为单分子检测最常用的方法。

（一）单分子荧光检测原理

在一定的条件下，对某荧光物质的稀溶液（abc＜0.05），荧光物质发出的荧光强度与该溶液的浓度呈正比。此为分子荧光分析法的定量依据。同样，在开放微区内平衡时记录的荧光信号强度也与其中的荧光分子数呈正比。在最佳条件下，1个分子大约能辐射出105～106个荧光光子。利用高效单光子计数雪崩光电二极管（APD），能接收到5%～10%的荧光光子。因此，可从一个荧光分子中观测到5000～50000个光子，不仅足以探测到单个分子，而且足以进行光谱辨认和实时监测。

当荧光素（或荧光标记物）标记分子通过高能量的激光焦点时，荧光素（或荧光标记物）所发射的光闪烁信号被检测器测得。光闪烁信号的次数和强度与分子浓度呈正相关性，通过对一定时间之内光闪烁信号进行统计，可以对溶液浓度进行定量检测。

（二）单分子荧光的特征

单分子荧光有两个典型特征：

1.量子跳跃特征

单分子荧光的主要特征之一是形成发射-暗态交替的量子跳跃过程，产生单分子荧光光谱和荧光强度涨落现象，量子跳跃特征是由单分子的周围环境及其猝灭途径决定的。通过测量单分子荧光的量子跳跃过程、荧光寿命及荧光量子产率，可以获得很多关于单个分子所在局域环境的特性及变化情况的信息。

2.荧光偏振特征

单个荧光分子具有唯一的固定吸收跃迁偶极矩，分子只吸收偏振方向与其吸收跃迁偶极矩方向一致的光子，并发出具有一定偏振方向的荧光。因此，在偏振激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以确定单个荧光分子的空间取向。在单分子检测中，就是利用单个分子跃迁偶极矩的方向及分子所处的环境差异来研究和推测生物大分子的结构和功能。

二、单分子荧光检测方法

单分子荧光探测必须满足两个基本条件：一是在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用，降低研究体系的浓度或密度可以实现；二是确保单分子的信号大于背景的干扰信号。尽可能减少拉曼散射、瑞利散射、溶液中杂质产生的荧光等背景信号对分析信号的干扰。减小检测体积可有效地降低周围环境产生的背景干扰。采用高效滤光片，要获得理想的信噪比需要激发体积最小化，利用共聚焦、近场和消失波激发，可以满足单分子荧光检测条件。根据所用仪器及对样品激发方式的不同，单分子荧光检测技术可分以下四种。

（一）近场扫描光学显微镜技术

近场扫描光学显微镜（near-field scanning optical microscope，NSOM）中的近场指光源与样品间的距离接近到纳米水平，而且光源通过针孔甚至光纤的尖端加以限制，分辨率由光源尺寸和光源-样品的间距决定，因而可以达到几十纳米的分辨率。

近场扫描光学显微镜的优点是具有较高的分辨率，已被用来研究单分子对荧光共振能量转移及单分子荧光成像。但有输出功率低、针尖制备的重复性较差及镀膜针尖对样品的检测会产生干扰等缺点。

（二）远场共聚焦显微镜技术

在光学设计中，共聚焦激光扫描显微镜（confocal scanning optical microscope CSOM）的激光束经物镜聚集到样品上，形成一个接近衍射极限的光斑，利用同一物镜收集样品反射回来的光，经一个直径为50～100μm的共焦小孔后被探测器接收，而非焦面的光则被小孔滤掉，保证了良好的光学收集效率和高信噪比。研究表明，运用这一方法研究溶液中的染料分子及荧光标记的蛋白质和DNA片段。远场共焦具有激发强度不受限制、非侵入式检测、灵敏度高及操作简单等优势，非常适合于研究单个给体和受体间的荧光共振能量转移。

（三）倒置荧光显微镜技术

倒置荧光显微镜（inverted microscope）是在普通的倒置荧光显微镜上添加一些简单的附件，便可用作单分子检测。光学系统主要包括激光光源、散焦光学装置、双色光束分离器和油浸物镜。配以电感耦合器件（charged coupled device，CCD）或超敏电感耦合器件（intensity charged coupled device，ICCD），则可进行高灵敏检测。目前用倒置荧光显微镜已观察到四甲基罗丹明标记的单个肌动蛋白细丝在酶解肌球蛋白上的滑动。

（四）消失波激发技术

在玻璃-液体/空气界面的全内反射产生指数衰减的消失场，在界面薄层上的分子可被消失波激发。消失波单分子成像的全套装置类似于倒置荧光成像，不同的是它的激发光束从物镜另一侧直接射向样品。消失波激发视野比较宽，样品厚度非常薄，具有更低的背景信号，是一种应用比较广泛的单分子荧光检测方法。研究表明，用这一方法来观测单个荧光团标记的肌球蛋白和肌动蛋白分子的运动，研究单个三磷酸腺苷（ATP）转化反应及细胞表面表皮生长因子受体的二聚化。

此外，原子力显微镜是扫描探针显微镜的一种，非常适合于从形貌角度分辨固定于玻片或云母表面的单个生物大分子，将原子力显微镜与共焦显微镜或荧光显微镜结合到一起，可同时获得分子的形貌和荧光信息，从而提供了一种更为直接的单分子检测方法。

单分子检测的研究对象，主要集中在较简单有机荧光染料分子（如罗丹明及其衍生物），但这些荧光染料存在光漂白现象。现在有三种类型纳米粒子可代替有机荧光染料用作荧光标记物：具有光学活性的金属纳米粒子；荧光纳米颗粒；量子点。单分子荧光检测形式可分为基本的三种：光子爆发检测、单分子图像记录和单分子光谱测绘。光子爆发检测最为简单，直接测定爆发的光子数。单分子成像可指示分子在图像中的位置和发光强弱，实时跟踪记录单分子。

三、单分子荧光检测的应用

在单分子水平上研究生物分子反应的动力学过程，研究分子的构象及构象随时间的变化，可以揭示生物大分子的结构和功能，尤其在生命科学中具有广阔的应用前景，为生命科学提供了新的研究手段。单分子检测在化学分析、DNA测序、纳米材料分析、医学诊断、法医分析、单DNA操纵、活细胞分析、分子动力学机制等方面都具有独特的应用价值，对许多学科领域的发展具有深远的影响。

（一）超灵敏分析

单分子检测的一个独特应用是分子计数和分类（荧光激活分子分选器），可对浓度极低的复杂溶液中的目标分子进行分析。它无需标准样品，可以很好地消除无关分子的干扰，且能利用对大量单分子事件的荧光相关分析获得极稀溶液的浓度。除了超稀溶液的分析外，单分子检测所用的样品体积极小，特别适于仪器微型化。超灵敏测定及成像技术在微流控芯片、生物芯片等微型和纳米器件中有着重要作用。如全内反射荧光显微术研究溶胶-凝胶膜中分子传输过程，可对各单分子运动轨迹进行跟踪。

（二）活细胞分析

活体细胞基体非常复杂，荧光背景高，激发光对细胞可能产生毒性作用，条件也不容易控制。2001年底，Brauchle等首次利用荧光单分子检测技术观测到病毒侵入活细胞的过程，并将其清楚地记录下来。Berland等将7nm和15nm荧光素标记羧基胶乳微球植入老鼠纤维原细胞，采用双光子荧光相关光谱研究了微球在细胞内的扩散行为。

（三）核酸研究

利用单分子检测技术作DNA序列的快速测定是目前极富挑战性的问题之一。其基本原理是用不同荧光标记的4种核苷酸合成长达几千碱基对的DNA片段，把DNA分子与微珠连接，放在缓冲液流的中间，流体中含有的外切核酸酶每隔一定时间消除一个核苷酸，剪切下的核苷酸分子流经激光束时根据它们的荧光标记物被逐个地检测和识别。研究表明，采用共聚焦荧光显微镜，可获得多种荧光参数，大大提高了测定准确度。

（四）分子马达的研究

分子马达（molecular motor），又称为分子发动机，是一类分布于细胞内部或细胞表面的蛋白质，它们的构象会随着与ATP和ADP的交替结合而改变，ATP水解的能量转化为机械能，引起马达形变，或者是它和与其结合的分子产生移动。分子马达本质上是一类ATP酶。一类由生物分子组成，具有马达（发动机）功能的分子机器，能够像马达一样依赖于微管推进细胞器运动，故称为分子马达。常见的分子马达多为蛋白质，其家族有：驱动蛋白、动力蛋白和依赖于微丝的肌球蛋白，利用ATP水解得到的能量（化学能）推动马达转动（动能），从而推动细胞器运动。

尽管目前可以测量单个分子马达的力和运动，但对力产生的分子机制即蛋白质结构的改变与力的产生有何关系仍不清楚。用荧光法检测附着在马达蛋白质上的单个荧光团可解决上述问题，单分子水平上的荧光偏振测量和机械力测量可以监测单个肌球蛋白分子的构象。

（五）单分子动力学研究

单分子荧光检测技术在单分子动力学研究方面得到广泛的应用，如光谱波动、扩散运动、构象变化和能量传递等。通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以确定单个荧光分子的空间取向，观测单分子的转动。如果将荧光分子标记到生物大分子的某一特定位置，实时分析单个荧光分子的偏振状态、荧光强度及荧光寿命等的变化，就可以了解生物大分子构象的状态及其变化的动力过程。如研究单个酶分子的反应活性，能揭示酶是否存在不同的构象。

生物单分子检测的研究尽管已取得了一些进展，但仍存在一些技术问题，尤其接近生理条件下和活细胞中的生物单分子的实时在线研究方法并不成熟，须进一步发展不易光解和性能稳定的荧光探针，代替传统的有机荧光染料等。随着分析方法和技术的不断完善，人们完全可能从单分子水平上揭示生命过程的奥秘。

（管春梅）