上篇
扫描电镜的原理与实用分析技术

第1章
光学显微镜和电子显微镜的发展回顾及其成像方式的比较

1.1　光学显微镜的发展简史及其几个主要基本概念

为了便于读者了解和掌握扫描电镜的原理，在介绍扫描电镜的原理之前我们先简单地回顾一下光学显微镜的发展简史及几个与电镜成像有关的基本词汇和概念。扫描电镜与光学显微镜这两者的基本成像原理有部分是相似或类似的。电子光学中应用的成像理论和概念，有的是从几何光学和物理光学中引申过来的。它们之间的主要区别：首先是照明源和聚焦成像的方式不同，在普通光学中采用的照明源是可见光，所用的聚焦部件是玻璃透镜，而在电子光学中采用的照明源是电子束，所用的聚焦部件是电磁透镜或静电透镜；其次是它们的作业环境不同，可见光的运作一般都是在大气环境中，而电子束的运作大多数是在高真空的环境中，有时也会用在低真空的环境中。

探索微观世界的奥秘是人类几千年来的愿望和追求，更何况随着科学技术的发展，人们更需要深入地研究和了解用于探索微观结构的仪器、设备。光学显微镜是能满足这种需求的主要仪器之一，它突破了人类的视觉极限，将人们的目光延伸到裸眼无法看清的微观世界之中。光学显微镜是利用可见光的光学成像原理，把原来人眼所不能分辨出来的微小物体放大成像，使人们能够看到微观结构和了解其内部信息的光学仪器。

自从有了光学显微镜，人们看到了之前未曾看到的许多微小生物和构成这些微小生物的基本单元——细胞。光学显微镜是继17世纪费马（Fermat）确立光线传播的最短光程原理，列文·虎克（A.V. Leeuwen hooke）在最简单的放大镜基础上设计出单透镜的显微镜之后，发展到今天结构十分复杂的复式显微镜。经过人们的不断研究、改进和发展，光学显微镜的结构已比较完善，分辨力也基本接近于理论值。特别是最近这几十年来，各种测量、相差、荧光、偏光和共焦等用于相应专业的显微镜先后诞生，它们被广泛地应用于医学、生物、材料等学科的科研、教学和生产当中。

1.1.1　光学显微镜的发展简史

早在两千多年前，人们就已发现通过球形的透明物体去观察微小物体可以使物体放大成像，后来逐渐对球形的玻璃透镜能使物体放大成像的规律有了初步的认识。在1590年前后，荷兰密得尔堡一个眼镜店的老板詹森已经能造出类似显微镜的放大工具，在1605年前后已做出雏形的显微镜。在1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒等物理学家在研究望远镜的原理时，通过改变物镜和目镜之间的距离，得出了合理的显微镜光路结构，使当时的一些光学专家和光学仪器爱好者先后投入了研制和改进显微镜的工作中去。17世纪中叶，荷兰的列文·虎克和英国的罗伯特·虎克（Robert·Hooke）都对显微镜的发展做出了卓越的贡献。17世纪60年代，列文·虎克不仅磨制出了第一个放大镜，还在之后的显微镜研制中加入了粗调焦机构、细调焦机构、照明系统和载物台，这些部件和结构经过后来的专家们不断优化和改进，都成为现代显微镜中不可缺少的组成部分。列文·虎克用自制的显微镜把物体放大到300倍，使人类看到了之前从未见到过的微观世界。罗伯特·虎克用自制的复合显微镜在世界上首次看到了细胞的内部微观结构。

17世纪70年代，列文·虎克制成了单组元放大镜式的高倍显微镜。列文·虎克和罗伯特·虎克各自利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出成就，这对后来的生物和医学学科的发展起到了直接的推动作用。图1.1.1为列文·虎克的肖像和他早期研制的几台典型光学显微镜之一的外形照片。

19世纪，高质量消色差浸没物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年米奇（Mickey）第一个采用了浸没物镜。1873年德国人阿贝（Abbe）和赫尔姆霍茨（Helmholfz）分别提出了解像力与照射光的波长成反比的理论，奠定了光学显微镜的经典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶，包括科赫、巴斯德等人在内的生物学家和医学专家发现细菌等微生物提供了不可缺少的观察工具。

在显微镜本身的结构得到发展的同时，显微观察技术也在不断地创新，1850年出现了偏光显微术，1893年出现了干涉显微术，1935年荷兰物理学家泽尔尼克研制出了相衬显微术。1988年商品的共焦显微镜开始推向市场。

古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械部件的组合，早期人们只能以眼睛作为基本的接收器来观察放大了的图像，后来显微镜中加入了摄像装置，以感光胶卷（负片）作为可以记录的媒介。而现代显微镜都采用光电元件、电视摄像管、电荷耦合器或半导体芯片等作为显微镜的微观图像的存储接收器，加配微型计算机后，便能构成完整的图像采集、信息处理、储存和转发系统。

图1.1.2～图1.1.5分别为现代的金相显微镜、红外显微镜、偏光显微镜、体视显微镜的外形图。

1.1.2　光学透镜的特性

1. 光的折射

光线在均匀各向同性介质中的两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则会发生折射现象，这是由于光在不同介质中的传播速度不同而造成的。当与透明物面不垂直的光线（如由空气）射入透明物体（如玻璃）时，光线会在其界面改变方向，并和法线构成折射角。

2. 玻璃透镜的性能

玻璃透镜是组成显微镜光学系统最基本且最重要的光学元件。物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个或多个透镜组成，依其外形的不同，可分为凸透镜、平面镜和凹透镜三大类，使用较多的为凸透镜，其中常用的组合是凸透镜和凹透镜的组合。

一束平行于光轴的光线通过凸透镜后会汇聚相交于一点，这点被称为“焦点”。通过焦点并垂直于光轴的平面被称为“焦平面”。焦点有两个，在物方空间的焦点称为“物方焦点”，该处的焦平面称为“物方焦平面”；反之，在像方空间的焦点称为“像方焦点”，该处的焦平面称为“像方焦平面”。光线通过凹透镜后，成正立虚像；而通过凸透镜则成倒立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像则不能显现出来。

3. 影响成像的关键因素——像差

由于客观条件，任何光学系统都不可能形成理论上理想的像，因各种像差的存在影响了成像质量，下面我们分别简要地介绍各种光学像差的概念。

1）色差

色差是由于透镜使用白（多）色可见光作为光源成像产生的一种缺陷。色差发生在照射光源为多色光混杂的情况下，若用单色光成像在理论上是不会产生色差的。因一般的可见光（白光）是由红、橙、黄、绿、青、蓝和紫七种颜色的光所组成的，由于各种颜色的光波长不同，所以当多色光通过透镜时它们的折射率也不同，这样当物方是一个点时，在像方则会形成一个小圆斑。色差一般由位置色差和放大率色差这两部分组成。位置色差使像在任何位置被观察时，都会带有色斑或晕环，使所成的像模糊不清，而放大率色差会使所成的像带有彩色的边缘。

2）球差

球差是轴上点的单色像差，它是由于透镜的球形表面形成的。球差造成的结果是一个圆点成像后，像方对应的不再是一个边缘清晰的圆亮点，而是一个中间亮，边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响所成像的清晰度。由于凸、凹透镜的球差是相反的，所以在光学显微镜中，球差可通过选配不同的凸、凹透镜组合的办法给予消除或矫正。在早期的显微镜中，其物镜的球差有的未能完全矫正好，分辨力就难以提高。它应与相应的补偿目镜配合才能达到好的补偿矫正效果，而新型高级光学显微镜的球差是通过物镜适当组合的方法来减少或消除的。

3）彗差

彗差属于轴外点的单色相差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交于一点，即原为一个圆点的物，通过透镜后在像方焦平面便会得到一个像逗点状的像，其形状犹如夜空中呈现在天空上运行的彗星，故称为“彗差”。

4）像散

像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场较大时，边缘上的物点离光轴较远，光束倾斜大，经透镜聚焦后则会引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想的像平面上合成后，形成一个椭圆形的斑点。可见光仪器中的像散是可以借助复杂的透镜组合来减少或消除的。

5）场曲

场曲是“像场弯曲”的简称。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想的像点重合，虽然在每个特定的点上都能得到清晰的像点，但整个像面不是处在一个平面上，而是处在一个弧形的曲面上。这样在像平面上不能同时看清整个像面，给图像的观察和拍摄造成了困难。因此，现代研究用的高级光学显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经把场曲矫正过来了。

6）畸变

前面所说的几种像差除场曲外，都会影响到像的清晰度。畸变是另一种性质的像差，光束的同心性不受破坏，因此不影响像的清晰度，但若把它所成的像与原物体比较，可能在某个方向上的放大就不能完全成比例或在形状上造成扭曲、失真，即在同一视场中各处的放大比例不相等。

上述介绍的这几种像差都是在显微镜、照相机、投影仪和摄像机等光学仪器中最常见和最主要的像差，这几种像差的概念也都已被引申到电子光学的学科中。

1.1.3　可见光的衍射

光学仪器中的某个小光栏相当于一个透光的小圆孔。从几何光学的观点来说，物体通过光学仪器成像时，每一个物点都会有一个对应的像点，但由于光的衍射，所产生的像点已不再是一个理想的对应几何点，而会变成一个有一定大小的艾里（Airy）亮斑，测量结果表明对于微小圆孔光栏的艾里斑强度大约84%集中在中心亮斑上，其余分布在外围的亮环上。由于外围亮环的强度比较低，一般人们的肉眼不易分辨和识别出来，只能看到中心亮斑。要想提高光学显微镜的分辨力（分辨能力的简称，亦称分辨本领，分辨能力是指显微镜所能分辨物像上相邻两点间的最小间距的能力），关键是降低照明光源的波长，因此对相邻的两个小物点，其相对应的两个艾里斑就会发生相互重叠，甚至无法分辨出两个物点。可见由于光的衍射现象，使光学仪器的分辨力受到了限制。什么情况下两个像斑刚好被分辨出来呢？瑞利提出了一个判据：当一个艾里斑的边缘与另一个艾里斑的中心正好重合时，此时对应的两个物点刚好能被人眼或光学仪器所分辨出来，这个判据被称为瑞利判据。

在图1.1.6中，从上到下，依次表示为物点、透镜、像平面、像平面上的光强度分布和像点。

（1）物点O1和O2经透镜衍射成两个艾里斑，实线为无衍射边界，虚线为衍射边界。

（2）物点O1和O2在像平面上的光强度分布。

（3）图1.1.6（a）图中的物点O1和O2在像平面上是完全可分辨出来的两个艾里斑。

（4）图1.1.6（b）图中的物点O1和O2在像平面上是刚好可分辨出来的两个艾里斑。

（5）图1.1.6（b）图中的物点O1和O2若靠得再近一些，即其光强度相差若小于26.5%（狭缝形的衍射为19%），则在像平面上就无法分辨出两个艾里斑。也就是说两个艾里斑的中心光强度为73.5%作为分辨力的临界判据。

光学显微镜一般都是利用波长在380～760nm的可见光来照射物体，但由于光的波动性所造成的衍射现象，使得光学显微镜的实际分辨力只有接近入射光波长的二分之一。这是在19世纪由德国的物理学家欧内斯特·阿贝（Ernest Abbe）根据衍射理论推导出来的。衍射效应使得传统的光学显微镜能够检测到的物体最小间距略大于照射光波长的一半。显微镜所成的放大像是否清楚不是取决于放大倍率，而是取决于显微镜的分辨力。大多数人的裸眼视力，在距离目标250mm处时能分辨物体的最小间距约为0.20mm，少数人的裸眼视力可达0.15mm。英国著名的物理学家——瑞利将欧内斯特·阿贝的衍射理论归纳为一个公式，这是由物理学家瑞利最先提出来的，因而得名瑞利公式，即分辨力d用瑞利公式表示：

式中，λ是入射光的波长；n是透镜介质的折射率；α是透镜孔径半角，在光学透镜中α≈70o；n sin α称为数值孔径，在空气中其值不大于1，在油浸透镜中其取值范围为1.5～1.6。

光学显微镜的分辨力取决于入射光的波长，由于可见光的波长较长，即使采用蓝绿光做照明源，其波长仍为450～570nm，其分辨力也很有限，d≈250nm；若采用紫光做照明源，其分辨力d≈200nm。这就是光学显微镜的分辨力不能再提高的主要原因。再增大数值孔径是很难的，而且是很有限的，唯有寻找比可见光波长更短的照射光源才能从根本上解决这个问题。提高光学显微镜分辨力的有效方法是改用波长更短的光源，这就只能采用电子束来替代可见光做照明源，这样才能显著地提高分辨力，其他的如采用紫光光源、采用浸没透镜的结构等办法都只能是稍微改善分辨力，很难能明显地提高分辨力，于是采用短波长的电子束作为照明源的电子显微镜便应运而生。