第三节　性病艾滋病实验室诊断的意义及技术进展

20世纪下半叶，各基础学科得到长足发展，客观上丰富了性病学的研究手段，使得人们对STD的病因、发病机制、治疗方法等研究逐渐深化。近年来，以分子生物学技术革新为先导，生命科学各领域均取得迅猛发展，它们与性病学不断发生交叉和融合，不仅提供了更为先进的研究手段，而且引导很多非医学领域科学家投身到性病学研究中，使相关研究工作水平显著提高。

一、性病艾滋病实验室检测的意义

实验室检测可以为性病艾滋病的诊断和临床疗效观察提供依据；在特定人群中开展某些项目的检测可以起到疫情评估的作用，为进一步防控措施的制定提供理论基础。

（一）为性病艾滋病临床诊断和疗效观察提供依据

实验室检查对传染病的诊疗具有特殊意义，病原体的检出或分离培养阳性可直接确诊相关疾病，免疫学检查可为临床诊断提供重要依据，某些特定的检测项目可为疗效和预后判断提供重要信息。

1.确诊有症状病例

同种病原体感染可引起不同的临床表现，不同的病原体感染可以引起相似的临床症状和体征。同一患者可同时患有多种STD，特别是女性的生殖道感染，医生仅根据临床表现及体征难以正确判断是何种病原体引起，无法得出正确的诊断。实验室检测可提供有症状的性病患者临床诊断依据，达到明确诊断、对症治疗的目的。

2.发现无症状感染

部分STD患者感染了性病病原体后，临床症状轻微或无症状。因其无任何不适或症状轻微，患者不易主动就诊，容易被忽略而造成漏诊。另一方面，此类患者因具有隐秘性而常导致其性伴侣及周围直接或间接接触者因未采取有效预防措施而感染，是最危险的传染源之一。实验室通过开发新技术，提高无症状性病感染者的筛查诊断水平，扩大对潜在易感人群（性工作者、男男性行为者、吸毒人员、供血者、青少年、流动人员等）及某些特定的人群（孕产妇、婚前检查人员）的筛查，以便主动及早发现这类无症状的性病感染者并进行规范性治疗，从而减少由于感染后未能得到及时治疗而引起严重的并发症及后遗症，以及由此引起的新的传播。

3.指导临床用药及耐药监测

使用抗菌药物是性病治疗的主要手段之一，实验室药敏结果可为临床合理用药提供指导；开展耐药监测工作，可提供当地菌株敏感性趋势的资料，及早提出预防措施。

4.观察疗效及判断治愈

性病治疗效果的正确评价，有助于尽早控制传染源、预防并发症及后遗症的发生。临床疗效的判断往往需要借助于实验室的检测，如对接受治疗的梅毒患者，定期进行非特异性梅毒螺旋体抗体定量试验（如RPR滴度试验）检测，如果滴度随治疗进程逐渐下降，则判断为治疗有效。此外，性病治愈与否往往亦需要通过实验室检测进行判断，如淋病治疗后，治愈的标准是通过尿道或宫颈取材涂片培养证实淋球菌的消除。

（二）为性病艾滋病防治策略提供依据

性病监测系统是通过综合的方法对特定地区和人群的性病流行病学、临床和实验室资料进行连续收集，分析性病的流行状况和趋势，是我国公共卫生监测系统的一个重要组成部分。从20世纪80年代起，我国开始开展性病监测工作。目前主要有两种方式：全国的传染病报告系统和性病监测哨点系统。其中性病疫情监测哨点系统的优点在于通过加强人员培训，提高实验室检测水平，更加规范地开展实验室诊断，使监测哨点的资料更加客观可靠，从而能够较准确地反映当地的流行情况。同时在性病监测哨点针对不同人群，采用高敏感性、高特异性的实验室检测技术开展感染率调查，可以为制定当地及全国的性病控制策略提供重要的科学依据。

二、性病实验室诊断技术进展

随着微生物学、生物化学、血液学、病理学以及分子生物学等领域研究技术的发展，相继形成了显微镜检查、病原体培养、血清学检测和分子生物学检测等基础的性病实验室诊断方法。

（一）病原学检查

1.显微镜检查

显微镜下观察到致病病原体是微生物感染的确凿证据。早在1875年 Edwin Klebs应用显微镜及细胞染色技术首先观察到了梅毒螺旋体。1879年，Albert Neisser在临床标本中发现了淋球菌。1889年Ducey发现了软下疳病原体杜克雷嗜血杆菌。1910年，Heymann在女性宫颈标本的上皮细胞内发现了衣原体包涵体，与此同时，Linder在非淋菌性尿道炎的男性尿道上皮中也观察到此包涵体的存在。1906年 Lansteriner发明暗视野显微镜检查梅毒螺旋体；1913年 noguchi和 Moore发明镀银染色用于梅毒螺旋体的检查。至今显微镜检查仍然是淋球菌、梅毒螺旋体等病原体检查的重要手段之一。电子显微镜技术的发展为STD病原体提供了高度敏感、特异的形态学检测手段，但因其设备昂贵、操作复杂，目前仅用于病原的微生物学研究。

2.病原体培养

除病毒、衣原体和立克次体外，一般的病原体都可用无生命的培养基培养和分离。病原体分离培养目前仍然是多种性病实验室诊断的“金标准”。1882年，Leistikow和 Loeffler最先报道了淋球菌的人工培养，但直到20世纪中期才开始用人工培养基分离培养临床标本中的STD病原体。1957年，我国汤飞凡教授等首次利用鸡胚卵黄囊分离培养出沙眼衣原体。20世纪60年代以来，细胞培养亦被广泛用于病毒分离，通过观察细胞病变效应来判断活病毒的存在与否，如单纯疱疹病毒培养。

3.抗原检测

20世纪70年代，多数STD通过镜检、培养或抗体检测进行临床诊断。1975年Kohler和 Milstein发明了单克隆抗体，从而进入性病抗原检测的时代，既可用于酶免疫测定，也可用于直接免疫荧光试验。血清抗原检查目前是生殖器疱疹病毒感染常用的试验诊断方法。采用免疫荧光和酶免疫法检测标本中生殖器疱疹病毒抗原敏感性可达70%～90%，特异性可达90%～100%。用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在皮损中直接检测到生殖器疱疹病毒抗原，能更准确地反映生殖器疱疹病毒的感染状态及感染部位，对诊断生殖器疱疹的活动性感染具有更直接的意义。

（二）血清学抗体检测

20世纪初期，Wassermann研制出补体结合血清学试验的方法，从而开始了梅毒血清学诊断方法的研究。20世纪40年代至50年代期间，免疫荧光被用于抗原和抗体检测。Coons于1950年介绍了荧光螺旋体抗体检测；1959年Deacon用免疫荧光法在患者分泌物中检测出了淋球菌抗体。1949年Nelson和 Mayer的免疫固定技术、1953年 Nelson的免疫黏附技术、1953年 Mcleod和 Magna的凝集技术等都被用于梅毒血清学检测。Dobson等证明新生儿梅毒患儿经适当青霉素治疗3个月后血清中IgM反应性即可消失，lgM抗体阳性可以作为梅毒活动性感染的标志。目前已开发的梅毒螺旋IgM抗体检测方法包括19s-1gM荧光抗体吸收试验、IgM固相血凝试验、梅毒螺旋体特异性lgM血凝试验和梅毒特异性IgM抗体捕捉ELISA试验等。TP-IgM蛋白印迹试验（Western blot，WB）则在WB基础上检测特异性lgM抗体，结合了免疫学和分子生物学的特点，具有较高的敏感性和特异性。

20世纪90年代以后发展了多种生殖器疱疹血清型特异性诊断方法，如针对特异性糖蛋白gG21、gG22的IgG血清抗体的蛋白印迹法（又称免疫印迹法）、ELISA法、竞争性 ELISA等方法。对于无皮损者，血清学试验是判断是否感染生殖器疱疹病毒的最好方法。型（HSV-1型和HSV-2型）特异性血清抗体检测是发现亚临床无症状感染者的最可行手段，对于防止生殖器疱疹的性传播和母婴传播有着重要意义，并在生殖器疱疹的临床研究、流行病学研究及监测中正发挥重要作用。

目前，抗体可以用多种方法进行检测，如ELISA法、化学发光法和酶联荧光法等，也可以用快速检测方法，包括凝胶颗粒凝集法、免疫斑点法、免疫层析法等检测。这些方法的共同特点为采样方便、操作简单、不需要特殊仪器、判断快速，有的只需要几分钟即可看结果，特别适用于不发达地区以及现场大规模的流行病学调查等。

（三）分子生物学实验诊断技术

利用分子生物学方法对各种性传播疾病进行病原学诊断，是近年来诊断技术发展的主流，特别是聚合酶链反应技术，因其具有3S特点，即敏感、特异、高效快速，现已广泛地用于病原微生物的检测，尤其是检测那些培养困难的病原微生物。

1.核酸探针

核酸探针试验是一种用杂交法来检测病原体DNA中特异序列的方法，是最早用于性病诊断的重组DNA技术。其原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补原则形成双链。此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是探针和待测核酸。待测核酸序列为病原体基因组或质粒DNA，它被固定在硝酸纤维膜、尼龙膜或其他载体上。探针以放射性核素或非放射性核素标记，使得杂交信号得以检测。在我国，核酸探针技术主要用于淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、人乳头瘤病毒和生殖器疱疹的实验研究，临床检测尚不普遍。

2.核酸扩增试验

核酸扩增试验是继核酸杂交试验之后又一重要的检测手段。这种试验通过扩增特定对象，如靶DNA或RNA、探针或杂交后产物的扩增，而使检测的敏感性大大提高。这方面研究最充分、应用最广泛的是聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），以及与之相关的免疫PCR、定量PCR以及多重PCR等。PCR可用于各种病原体的检测，临床主要用于沙眼衣原体感染、HIV感染、梅毒以及HPV感染的检测，并且是目前HPV的主要实验诊断技术和研究方法。目前实时荧光PCR越来越受到重视，国内已经开发了沙眼衣原体、支原体等实时荧光PCR检测试剂盒。

3.分子生物学诊断方法的不足

分子生物学诊断方法亦有其不足之处：所需的仪器设备和试剂价格比较昂贵，且对实验室空间设置有严格要求，普通实验室尚不能配备，难以在全国范围内普遍开展；实验过程中有可能因外界污染而出现假阳性结果，实验室一旦污染，难以去污染；某些抑制物能影响PCR反应，如血红素、去污剂、肝素以及尿中的亚硝酸盐和结晶等，从而出现假阴性结果；只能鉴定病原体，为临床诊断提供帮助，但不能获得药物敏感性信息。因此，加强PCR的质量控制，包括规范的实验室配置，严格无菌操作、选用特异性引物、高纯度试剂及设置对照，是保证试验成功的必要条件。

三、性病实验室检查方法与检测策略

通常在理想状态下，某种疾病具有诊断的“金标准”（gold standard）。该“金标准”为公认的最可靠、最权威，能够反映“有病”和“无病”状态的方法。如活检、尸检、手术发现、微生物培养、影像诊断以及长期随访结果等能确证某种疾病或感染病原体存在。性病艾滋病实质为感染性疾病，微生物培养出病原体或直接观察到病原体是其诊断的“金标准”。但在实际工作中，“金标准”往往难以获得，因此实验室需要采用其他方法对其进行诊断或辅助诊断（绪论表1-2）。

除“金标准”外，其余的试验方法按照用途可以分为筛查试验和诊断试验。一般用于筛查的方法灵敏度越高，越有可能将患病可能的病患区分出来。而用于诊断的方法，要求其特异性越高越好，以保证没有患病的人尽可能少的被误诊为有病。两者是相对的，在不同的场合下，同一试验既可以被用作筛查试验，亦可以被用于诊断试验。如化学发光法检测HIV抗体，由于灵敏度高，可用于普通人群的HIV感染者/AIDS患者（人类免疫缺陷病毒感染者/获得性免疫缺陷综合征患者）筛查。同时，亦可以作为感染率高于30%人群HIV感染者/AIDS患者诊断试验。

实验室方法的灵敏度和特异性两方面的特性是该方法区分疾病和非患病的重要指标。但这两个指标难以得兼，往往灵敏度高的方法，其特异性较低，相反，灵敏度低的方法，特异性高。用于疾病诊断的情况下，一种方法灵敏度越高，其将有病的人检出的可能性越大，但与此同时，将非患病人群误诊为患病的概率也增加。

实际上，没有任何一种实验室检测方法可谓绝对的“金标准”。针对某一具体性病实验诊断的“金标准”往往是相对的。随着科技的发展，各种性病实验室诊断的“金标准”也会不断更新。因此，性病的防治实践中有时会将多种实验室检测方法联合使用，形成检测策略以达到不同的检测目的，如诊断、疫情评估、献血安全筛查、婴幼儿感染的早期诊断等。检测策略一般以多种方法的串联或并联形式展开。①串联策略：串联策略一般分为筛查试验、诊断试验，某些情况下可能设置确证试验，且按序次展开，只有诊断试验/确证试验均为阳性时方可进行确诊，其特异性高，艾滋病和梅毒诊断策略属于此类。②并联策略：并联策略常为多种敏感度高的方法平行检测，以筛查出可疑检测对象，故并联策略敏感度高，如采供血系统为保证用血安全，常采用核酸、血清学等多种方法同时检测，一种或一种以上的阳性予以排除，以尽最大可能筛查出不安全的献血者。③串联、并联混合的策略。因此，应依据不同的检测目的，采用不同的检测策略。另外，针对不同的检测对象，如母婴传播时的婴幼儿、高危人群等，也应采用不同的检测策略。